Анализ Суспензии клеток, выделенная из твердых тканей с помощью спектральной проточной цитометрии

Общая цель этого метода спектральной цитометрии состоит в том, чтобы различать различные флуорохромы по всему спектру их излучения. Более того, этот протокол позволяет реализовать автофлуоресценцию в качестве независимого параметра, что позволяет проводить надлежащий анализ клеток, выделенных из солидных органов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии и развития биологии стволовых клеток, например, как идентифицировать популяции редких клеток.

Основным преимуществом этой методики является ее уникальная способность одновременно анализировать большое количество параметров, а также управлять автофлуоресценцией твердых тканей. Несмотря на то, что этот метод используется для приготовления одноклеточной суспензии, полученной из кишечника и сердца, он также может быть применен к другим органам, таким как легкие, скелет, мышцы, печень, жир и почки. Для начала изолируйте и промойте тонкий кишечник от взрослой мыши.

Затем положите салфетку на бумажное полотенце, и с помощью острых ножниц аккуратно удалите пейеровы пятна. Вскройте кишечник, разрезав его продольно, и разделите на кусочки по одному сантиметру. Затем перенесите ткань в стакан, наполненный 30 миллилитрами HBSS с добавлением десяти процентов FCS, и инкубируйте его при температуре 37 градусов Цельсия при постоянном помешивании в течение 30 минут.

Как только инкубация будет завершена, переложите клеточную суспензию в пластиковую трубку объемом 15 миллилитров и энергично переведите ее в течение пяти минут. Затем инкубируйте суспензию на льду в течение десяти минут, чтобы крупные недиссоциированные фрагменты оседали. После этого перенесите надосадочную жидкость в новую трубку и вращайте клетки со скоростью 120 G в течение семи минут.

После гранулирования мы суспендируем клетки в десяти миллилитрах одного процента FCS в HBSS и подсчитываем их с помощью камеры Нейбауэра. Перед окрашиванием клеток перенесите один раз на десять-шестую клетки кишечника в пятимиллилитровую пробирку, чтобы получить отрицательный контроль. Чтобы приготовить образец, добавьте один раз от десяти до шестой клеток кишечника, а затем два миллилитра HBSS с одним процентом FCS в новую пятимиллилитровую пробирку и центрифугируйте суспензию при 120-кратном G, при четырех градусах Цельсия, в течение пяти минут.

После отбрасывания надосадочной жидкости мы суспендируем клетки в 50 микролитрах раствора антител. Оберните трубку алюминиевой фольгой и инкубируйте клетки при температуре четыре градуса Цельсия в течение 20 минут. Как только инкубация будет завершена, добавьте в образец два миллилитра однопроцентного FCS в HBSS и центрифугируйте его при температуре 120 раз G (четыре градуса Цельсия) в течение пяти минут.

Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 200 микролитрах 0,5 микрограмма на миллилитры раствора йодида пропидия. После обезглавливания эмбриона мыши замочите его тело в чашке Петри, выстланной предварительно смоченным бумажным полотенцем и наполненной 50 миллилитрами одного процента FCS в HBSS. Под стереомикроскопом сделайте разрез с правой стороны грудной клетки эмбриона и осторожно вскройте грудную клетку, не допуская повреждения сердца.

Захватите крупные сосуды и вытащите сердце, связанное с легкими и вилочковой железой. Перенесите органы в 35-миллилитровую чашку Петри, наполненную двумя миллилитрами однопроцентной FCS в HBSS. Затем изолируйте сердце от окружающих органов и соединительной ткани.

Промыв сердце, замочите его в одном миллилитре предварительно подогретого ферментативного раствора, и с помощью тонких щипцов и скальпеля измельчите орган на кусочки по одному кубическому миллиметру под стереомикроскопом. Добавьте дополнительно один миллилитр предварительно подогретого ферментативного раствора и перенесите фрагментированную ткань в закрытую пятимиллилитровую трубку. Инкубируйте образец в горизонтальном положении при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут.

После завершения инкубации гомогенизируйте ткань путем повторного пипетирования суспензии с помощью пипетки P1000. Затем установите образцы, расположив их вертикально, в сторону до тех пор, пока фрагменты непереваренных тканей не осядут. Переложите надосадочную жидкость в трубку объемом 50 миллилитров.

Добавьте два миллилитра десятипроцентного FCS в HBSS и держите изолированные клетки на льду. Затем добавьте два миллилитра предварительно подогретого ферментативного раствора в пятимиллилитровую пробирку, содержащую непереваренный осадок ткани, и продолжайте переваривать ткань, как показано ранее, до тех пор, пока не исчезнут остатки ткани. Полученную клеточную суспензию центрифугировать при 120-кратном G в течение десяти минут.

Затем отбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в одном миллилитре одного процента FCS в HBSS, без катионов кальция и магния. Чтобы окрашивать сердечные клетки, переложите 200 микролитров клеточной суспензии в лунки круглого дна 96-луночной пластины. Центрифугируйте планшет при 480-кратном G в течение одной минуты и выбросьте надосадочную жидкость.

Далее ресуспендируйте сердечные клетки в 100 микролитрах раствора антитела. Оберните тарелку алюминиевой фольгой и выдержите ее при температуре четыре градуса Цельсия в течение 20 минут. После завершения инкубации промойте сердечные клетки 200 микролитрами однопроцентного FCS в HBSS, не содержащем кальция и магния, и центрифугируйте суспензию в 480 раз больше G в течение одной минуты.

Затем ресуспендируйте клетки в 200 микролитрах однопроцентного FCS в HBSS без ионов кальция и магния и перенесите суспензию в пятимиллилитровую пробирку, предварительно заполненную 200 микролитрами однопроцентного FCS в HBSS без кальция и магния. Наконец, добавьте 400 микролитров однопроцентного FCS в HBSS без катионов кальция и магния, содержащих 0,5 микрограмма йодида пропидиума на миллилитр, и отфильтруйте клеточную суспензию через нейлоновую сетку толщиной 70 микрометров. Чтобы визуализировать клетки, загрузите окрашенный образец в проточную цитометрию и нажмите кнопку предварительного просмотра, а затем запишите до двух десяти-шестых событий в образце, нажав кнопку «Получить».

Во вкладке анализа откройте окно цветовой палитры и зарегистрируйте все изучаемые параметры, добавив флуорохром вместе с соответствующим маркером. Обязательно укажите параметры автофлуоресценции и жизнеспособности. В окне управления, в списке пробирок, проанализируйте первый одиночный окрашенный образец, содержащий компенсационные шарики.

Затем на листе нажмите на инструмент проектирования полигонов и закрутите популяцию бусин на графике FSC SSC. Дважды кликните по воротам, чтобы создать дочерний участок из забитых бусин. А дальше затвор положительного и отрицательного бусин отдельно.

Проверьте выбранную дочернюю популяцию путем последовательного гейтирования и исключения выбросов в каждой положительной и отрицательной дроби. Затем загрузите отрицательный и положительный вентили в окне восстановления микширования. Затем выберите образец неокрашенной клетки в списке пробирок и спроектируйте отдельные затворы для автофлуоресцентных и неавтофлуоресцентных клеток.

После того, как отрицательные и положительные вентили определены для всех параметров, включая автофлуоресценцию и жизнеспособность, нажмите кнопку «Рассчитать». Затем примените размешивание к анализируемым образцам. Чтобы проанализировать данные, забейте клетки на графике зависимости SSC от FSC и исключите мертвые клетки, окрашенные йодидом пропидия.

Наконец, определите вентили для всех интересующих популяций. Представлены результаты анализа проточной цитометрии и спектральной цитометрии клеток, выделенных из сердца плода и окрашенных антителами против TER119, анти-CD45 и анти-Sca-1. Подмножество аутофлуоресцентных клеток было обнаружено с помощью двух обычных цитометров, в то время как в спектральной цитометрии эти клетки не определялись как автофлуоресцентные и входили в CD45 TER119-отрицательную популяцию.

Клетки, идентифицированные с помощью обычной проточной цитометрии как аутофлуоресцентные, но не CD31-положительные, были затем проанализированы на экспрессию транскриптов, специфичных для кардиомиоцитов. Высокие уровни сердечного тропонина и миоцитов предсердий, таких как трейн-транскрипты, были обнаружены в популяции аутофлуоресцентных клеток, что подтверждает, что большое подмножество кардиомиоцитов отсутствует при обычной проточной цитометрии. После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за восемь часов, если она правильно отформована.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что все шаги должны быть выполнены на льду и своевременно, чтобы клетки оставались жизнеспособными. После этой процедуры могут быть получены внутриклеточные белки и анализы дополнительных поверхностных маркеров, чтобы ответить на вопросы, касающиеся конкретных молекулярных путей. Этот метод проложил путь для исследователей в области иммунологии и биологии развития или стволовых клеток для изучения и выделения редких популяций из различных органов.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделять и окрашивать клетки из клеточных тканей, а также как анализировать экспрессию поверхностных маркеров с помощью спектральной проточной цитометрии, которая преодолевает ограничения, возникающие в результате автофлуоресценции клеток. Не забывайте, что работа с йодидом пропидиума может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование СИЗ.