Анализ Суспензии клеток, выделенная из твердых тканей с помощью спектральной проточной цитометрии

Общая цель данного метода спектральной цитометрии заключается в различении различных флуорохромов по их полным спектрам испускания. Более того, данный протокол позволяет использовать аутофлуоресценцию в качестве независимого параметра, что обеспечивает возможность корректного анализа клеток, выделенных из солидных органов. Этот метод может помочь в решении ключевых вопросов в области иммунологии и биологии стволовых клеток, например, в вопросах идентификации редких популяций клеток.

Основным преимуществом данного метода является его уникальная способность одновременно анализировать большое количество параметров и контролировать автофлуоресценцию твердых тканей. Хотя данный метод используется для приготовления суспензии отдельных клеток кишечника и сердца, его также можно применять к другим органам, таким как легкие, скелетные мышцы, печень, жировая ткань и почки. Для начала изолируйте и промойте тонкий кишечник взрослой мыши.

Затем поместите ткань на бумажное полотенце и с помощью острых ножниц аккуратно удалите пейеровы бляшки. Вскройте кишечник, разрезав его вдоль, и разделите на фрагменты длиной один сантиметр. Затем перенесите ткань в стакан, наполненный 30 миллилитрами HBSS с добавлением десяти процентов FCS, и инкубируйте при 37 °C при постоянном перемешивании в течение 30 минут.

По завершении инкубации перенесите клеточную суспензию в пластиковую пробирку объемом 15 мл и интенсивно перемешайте ее на вортексе в течение пяти минут. Затем выдержите суспензию на льду десять минут, чтобы крупные недиссоциированные фрагменты осели. После этого перенесите супернатант в новую пробирку и центрифугируйте клетки при 120 ×g в течение семи минут.

После осаждения мы суспендируем клетки в 10 мл 1% FCS в HBSS и подсчитываем их с помощью камеры Нойбауэра. Перед окрашиванием клеток перенесите 1×10⁶ кишечных клеток в пробирку объемом 5 мл для подготовки отрицательного контроля. Для подготовки образца добавьте 1×10⁶ кишечных клеток, а затем 2 мл HBSS с 1% FCS в новую пробирку объемом 5 мл и центрифугируйте суспензию при 120 ×g при температуре 4 °C в течение 5 минут.

После удаления супернатанта мы суспендируем клетки в 50 µl раствора антител. Оберните пробирку алюминиевой фольгой и инкубируйте клетки при температуре 4 °C в течение 20 минут. По завершении инкубации добавьте в образец 2 мл 1% FCS в HBSS и центрифугируйте его при 120 ×g, 4 °C, в течение пяти минут.

Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 200 µL раствора пропидия йодида с концентрацией 0.5 µg/mL. После декапитации эмбриона мыши поместите его тело в чашку Петри, выстланную предварительно смоченным бумажным полотенцем и заполненную 50 mL 1% FCS в HBSS. Под стереомикроскопом сделайте разрез с правой стороны грудной клетки эмбриона и осторожно откройте грудную полость, стараясь не повредить сердце.

Захватите крупные сосуды и извлеките сердце вместе с легкими и тимусом. Перенесите органы в чашку Петри объемом 35 мл, заполненную 2 мл 1% FCS в HBSS. Затем отделите сердце от окружающих органов и соединительной ткани.

После промывания сердца погрузите его в один миллилитр предварительно нагретого ферментативного раствора, а затем с помощью тонкого пинцета и скальпеля измельчите орган на кусочки размером один кубический миллиметр под стереомикроскопом. Добавьте еще один миллилитр предварительно нагретого ферментативного раствора и перенесите фрагментированную ткань в закрытую пробирку объемом пять миллилитров. Инкубируйте образец в горизонтальном положении при 37 °C в течение 15 минут.

По завершении инкубации гомогенизируйте ткань путем многократного пипетирования суспензии с помощью дозатора P1000. Затем оставьте образцы в вертикальном положении до осаждения фрагментов непереваренной ткани. Перенесите супернатант в пробирку объемом 50 мл.

Добавьте 2 мл 10% FCS в HBSS и содержите изолированные клетки на льду. Затем добавьте 2 мл предварительно нагретого ферментативного раствора в пробирку объемом 5 мл, содержащую непереваренный осадок ткани, и продолжайте расщепление ткани, как было показано ранее, до полного ее исчезновения. Центрифугируйте полученную клеточную суспензию при 120 ×g в течение 10 минут.

Затем удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в 1 mL 1% FCS в HBSS без катионов кальция и магния. Для окрашивания сердечных клеток перенесите 200 µL клеточной суспензии в лунки 96-луночного планшета с круглым дном. Центрифугируйте планшет при 480 ×g в течение одной минуты и удалите супернатант.

Затем ресуспендируйте клетки сердца в 100 µL раствора антител. Оберните планшет алюминиевой фольгой и инкубируйте при температуре 4 °C в течение 20 минут. По завершении инкубации промойте клетки сердца 200 µL 1% раствора FCS в HBSS без кальция и магния и центрифугируйте суспензию при 480 ×g в течение одной минуты.

Затем ресуспендируйте клетки в 200 µL 1% FCS в HBSS без ионов кальция и магния и перенесите суспензию в пробирку объемом 5 mL, предварительно заполненную 200 µL 1% FCS в HBSS без кальция и магния. Наконец, добавьте 400 µL 1% FCS в HBSS без катионов кальция и магния, содержащего 0,5 µg/mL пропидиййодида, и профильтруйте клеточную суспензию через нейлоновую сетку с размером ячеек 70 µm. Чтобы визуализировать клетки, загрузите окрашенный образец в проточный цитометр и нажмите preview, затем зарегистрируйте до 2×10⁶ событий в образце, нажав acquire.

На вкладке анализа откройте окно цветовой палитры и зарегистрируйте все исследуемые параметры, добавив флуорохром и соответствующий ему маркер. Обязательно включите параметры автофлуоресценции и жизнеспособности. В окне управления, в списке пробирок, проанализируйте первый образец с одиночным окрашиванием, содержащий компенсационные бусины.

Затем на рабочем листе выберите инструмент рисования многоугольников и выделите популяцию микросфер на диаграмме FSC SSC. Дважды щелкните по области выделения (гейту), чтобы создать дочернюю диаграмму для выделенных микросфер. После этого по отдельности выделите положительные и отрицательные микросферы.

Подтвердите выбранную дочернюю популяцию путем последовательного гейтирования и исключения выбросов в каждой положительной и отрицательной фракции. Затем загрузите отрицательный и положительный гейты в окно размиксования (un-mixing). Далее выберите образец неокрашенных клеток в списке пробирок и создайте отдельные гейты для автофлуоресцентных и неавтофлуоресцентных клеток.

После определения негативных и позитивных гейтов для всех параметров, включая автофлуоресценцию и жизнеспособность, нажмите «calculate» (рассчитать). Затем примените развёртку (un-mixing) к анализируемым образцам. Для анализа данных проведите гейтирование клеток на графике SSC в зависимости от FSC и исключите мёртвые клетки, окрашенные пропидиумйодидом.

Наконец, определите гейты для всех интересующих популяций. Здесь представлены результаты проточной и спектральной цитометрии клеток, выделенных из сердца плода и окрашенных антителами к TER119, CD45 и Sca-1. Подмножество клеток с аутофлуоресценцией было обнаружено двумя стандартными цитометрами, в то время как при спектральной цитометрии эти клетки не были определены как аутофлуоресцентные и вошли в популяцию CD45 TER119-отрицательных клеток.

Клетки, определенные с помощью традиционной проточной цитометрии как аутофлуоресцентные, но не являющиеся CD31-положительными, затем были проанализированы на экспрессию транскриптов, специфичных для кардиомиоцитов. В популяции аутофлуоресцентных клеток были обнаружены высокие уровни сердечного тропонина и транскриптов, характерных для миоцитов предсердий, что подтверждает тот факт, что при использовании традиционной проточной цитометрии упускается значительная часть кардиомиоцитов. После освоения эта методика может быть выполнена примерно за восемь часов при условии правильного проведения процедуры.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что все этапы должны проводиться на льду и в строго определенные временные интервалы, чтобы обеспечить жизнеспособность клеток. После выполнения этой процедуры можно провести анализ внутриклеточных белков и дополнительных поверхностных маркеров для изучения конкретных молекулярных путей. Этот метод открыл исследователям в области иммунологии, биологии развития и биологии стволовых клеток возможность изучать и изолировать редкие популяции клеток из различных органов.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изолировать и окрашивать клетки из клеточных тканей, а также о том, как анализировать экспрессию поверхностных маркеров методом спектральной проточной цитометрии, которая позволяет преодолеть ограничения, вызванные автофлуоресценцией клеток. Не забывайте, что работа с пропидиййодидом может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование СИЗ.