Как изучать базальной мембраны Жесткость как биофизической Trigger в раке простаты и других патологий, связанных с возрастом или метаболических заболеваний

Общая цель этой модели состоит в том, чтобы исследовать, как жесткость и толщина базальной мембраны, обусловленная прогрессирующим гликированием и воздействием продукта, может модулировать инвазивное поведение клеток, соответствующее ранним и поздним стадиям метастатического рака предстательной железы. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области возрастных патологий. Например, как повышенная жесткость и толщина базальной мембраны способствует прогрессированию рака, а также метаболическим нарушениям, таким как диабет.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что она обеспечивает простой метод имитации уровня жесткости, измеренного в опухолях предстательной железы человека в клинических условиях. Применение этого метода распространяется на нашу терапию и диагностику рака предстательной железы, улучшая наше понимание того, как жесткость базальной мембраны способствует молекулярным и клеточным изменениям. Люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности, потому что модель является мультидисциплинарной.

Сочетание техник из областей химии, физики и биологии. Впервые у нас появилась идея этого метода, когда мы предположили, что жесткость базальной мембраны в предстательной железе может способствовать de novo инвазивному поведению в известных трансформированных эпителиальных клетках. Видеодемонстрация этого метода имеет решающее значение, потому что необходимо описать междисциплинарные шаги.

В том числе сшивание базальной мембраны с последующим 3D-культивированием клеток. Начните с подготовки ровной поверхности льда и использования ее для охлаждения стеклянного стекла с восемью лунками до четырех градусов Цельсия. Затем отрежьте конец наконечника пипетки объемом 200 микролитров и охладите его до четырех градусов Цельсия.

После остывания поместите наконечник на вспомогательное средство для пипетирования емкостью 200 микролитров. И с его помощью перекачивать по 40 микролитров ледяного матричного раствора БМ в каждую лунку охлаждаемого стеклянного стекла с восемью лунками. Затем поместите предметное стекло камеры при температуре 37 градусов Цельсия на 30 минут, чтобы стимулировать полимеризацию базальной мембраны.

Очень осторожно закройте дверцу инкубатора, чтобы не повредить жидкость восстановленной базальной мембраны. Ровно через 30 минут добавьте 250 микролитров приготовленного раствора гликолевого альдегида, чтобы покрыть полимеризованную, восстановленную базальную мембрану. Затем приготовьте отрицательный контроль, добавив 250 микролитров стерильного PDS к нативному, восстановленному гелю базальной мембраны.

Кроме того, приготовьте два дополнительных контроля, добавив либо 50 миллимолярный цианоборогидрид натрия, либо 250 миллимоллярный аминогуанидин в раствор гликолевого альдегида перед добавлением его в гель базальной мембраны. Затем инкубируйте гели при температуре 37 градусов Цельсия в течение шести часов, чтобы получить полужесткий гель. Или в течение 14 часов для получения густого геля.

После инкубации осторожно удалите растворы из гелей и добавьте в каждый гель по 250 микролитров этилового эфира глицина одного моляра. И инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Промойте каждый гель 10 раз в 500 микролитрах PBS, чтобы удалить все следы раствора гликолальдегида и этилового эфира глицина.

Затем добавьте 400 микролитров PBS для предотвращения обезвоживания и инкубируйте восстановленные гели базальной мембраны в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. Когда вы будете готовы продолжить, удалите PBS из восстановленных гелей базальной мембраны и добавьте 250 микролитров ледяной воды двойной дистилляции в каждую лунку. Инкубируйте гели при температуре четыре градуса Цельсия в течение 16-24 часов, чтобы убедиться, что матрица полностью разжижена.

Затем переложите сжиженную базальную мембрану в пробирку объемом 1,5 миллилитра, и измерьте флуоресцентное излучение раствора с помощью спектрофотометра. Затем центрифугируйте раствор и удалите образовавшуюся надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах раствора, содержащего 20 мг на миллилитр цианогена бромида и 70% муравьиной кислоты.

Инкубируйте образцы в течение ночи при комнатной температуре. Затем с помощью одноразового шприца объемом в один миллилитр перенесите повторно суспензированный гель базальной мембраны в диализную кассету с молекулярной массой 3,5 килодальтоны. Погрузите кассету в стеклянный стакан объемом 500 миллилитров, содержащий 500 миллилитров воды двойной дистилляции.

И перемешайте воду с помощью магнитной мешалки. Поместите эту установку на ночь при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы удалить все следы цианогена бромида и муравьиной кислоты. С помощью одноразового шприца объемом в один миллилитр переведите набранный раствор из кассеты в пробирку объемом 1,5 миллилитра.

Затем проанализируйте раствор, запустив его на 12% полиакриламидный гель. Окрасьте гель серебристым красителем, чтобы визуализировать электрофоретическую картину пептидов матрицы бромида цианогена. Начиная с гелей базальной мембраны, покрытых PBS, промойте гели еще два раза, с 300 микролитрами PBS, содержащими 0,1 миллимоль хлорида кальция.

И 0,5 миллимоля хлорида магния. В течение пяти минут при комнатной температуре. Затем удалите PBS и добавьте 300 микролитров 4% параформальдегида, чтобы покрыть каждый восстановленный гель базальной мембраны.

Инкубируйте гели в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы зафиксировать восстановленные компоненты базальной мембраны. Далее снимите фиксатор и добавьте 300 микролитров гасящего раствора, содержащего 75 миллимоль хлорида аммония и 0,5 миллимоля хлорида магния. Выдержите раствор в течение пяти минут при комнатной температуре, а затем удалите раствор и повторите полоскание еще четыре раза.

После окончательного промывания добавьте 300 микролитров иммунофлуоресцентного буфера в восстановленные гели базальной мембраны для предотвращения неспецифических реакций. Инкубируйте гели в растворе в течение двух часов при комнатной температуре на встряхивающей платформе. Затем удалите буфер, блокирующий иммунофлуоресценцию.

И добавить 300 микролитров первичного антитела, которое разведено в блокирующем буфере. Инкубируйте восстановленные гели базальной мембраны при температуре четыре градуса Цельсия в течение 16 часов. На следующий день удалите первичное антитело и трижды промойте гели 300 микролитрами иммунофлуоресцентного буфера.

Встряхивайте гели при комнатной температуре на встряхивающей платформе в течение 10 минут после каждого добавления буфера. Затем удалите буфер и добавьте 300 микролитров флуоресцентно меченного вторичного антитела, разведенного в блокирующем буфере. Поместите образцы на платформу для встряхивания и инкубируйте гели в течение двух часов при комнатной температуре.

Удалите вторичное антитело. Промойте образец в иммунофлуоресцентном буфере, а затем PBS, а затем зафиксируйте и закалите образцы во второй раз. Наконец, установите гели и с помощью микроскопа проанализируйте образование плотных пучков.

Для формирования ацинуса предстательной железы разводят 5 000 клеток RWPE-1 в 300 микролитрах полного КСФМ, дополненного 2% раствором базальной мембраны. Для агрегатов клеток опухоли предстательной железы разведите 2 500 клеток PC3 в 300 микролитрах питательной среды RPMI-1640 с добавлением 2% раствора базальной мембраны. После ночной инкубации восстановленных гелей базальной мембраны в PBS дважды промойте их 500 микролитрами питательной среды.

Перед затравкой клеток. Аккуратно засейте клетки на нативные и усовершенствованные восстановленные базальные мембраны, укрепленные конечным продуктом гликирования. И аккуратно помещайте культуры в инкубатор, чтобы обеспечить равномерное распределение растущих ацинусов и сфероидов.

Для клеток, образующих ацинусы, каждые два дня меняйте среду на свежую питательную среду, содержащую 2% раствора базальной мембраны. Для обеспечения клеток факторами роста, необходимыми для нормального гомеостаза ацинусов. После шести дней культивирования эпителиальные клетки предстательной железы образуют ацинусы на нативной восстановленной базальной мембране.

И организованы в однородные сфероиды эпителиальных клеток. Эти ацинусы также обладают характеристиками высокоорганизованных ПЭК с апикальной и базальной полярностью и видимым световым пространством. При культивировании в течение шести дней на жесткой мембране клетки имеют нарушенную архитектуру.

И менять форму с сфероидальной на полигональную. Кроме того, эти ацинусы сильно дезорганизованы. И утратили свою апикальную или базальную полярность, с малым или отсутствующим просветным пространством.

Это также верно для клеток, полученных из предстательной железы, пораженной доброкачественной гиперплазией предстательной железы. Когда клетки опухоли предстательной железы были измерены, было обнаружено, что клетки были длиннее на жесткой, восстановленной базальной мембране, а также мигрировали быстрее и имели повышенную клеточную персистенцию. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как моделировать влияние жесткости базальной мембраны на поведение эпителиальных и опухолевых клеток.

При проведении этой процедуры важно помнить, что создается желаемый уровень жесткости базальной мембраны, а также правильно формируются отдельные ацинусы или s-сфероиды. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области онкологии к изучению индукции инвазии раковых клеток за счет жесткости базальной мембраны в предстательной железе. Следуя этому протоколу, можно провести другой метод, такой как иммуноблоттинг клеточного лизата, чтобы ответить на дополнительные вопросы, связанные с сигнальным путем, модулируемым жесткостью базальной мембраны.

Не забывайте, что работа с цианоборогидридом натрия, бромидом цианогена и муравьиной кислотой может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение лабораторного халата, перчаток, лицевого щитка и респиратора во время работы в вытяжном шкафу.