Обнаружение измененных форм цитозина с использованием чувствительных иммуногистохимии

Общая цель данного иммунохимического протокола — оценить пространственное распределение модифицированных форм цитозина в различных тканевых и клеточных контекстах с использованием конъюгированных с пероксидазой вторичных антител и тирамидного усиления сигнала. Этот метод позволяет преодолеть ограничения других методик, которые не предоставляют пространственной информации, необходимой для понимания биологической функции модифицированных форм цитозина. Кроме того, данный метод позволяет проводить совместную детекцию модифицированных форм цитозина с маркерами клеточных линий и может быть использован для изучения их ядерной локализации.

Для начала данной процедуры зафиксируйте регидратированные срезы тканей эмбрионов мышей линии CD1 дикого типа и тканей мозга взрослых особей, поместив их либо в ледяной 4% PFA, либо в 4% FA на 15 минут при комнатной температуре. Затем удалите избыток фиксатора, промывая срезы в PBS в течение пяти минут при комнатной температуре. После этого проведите пермеабилизацию срезов тканей, поместив их в стакан Коплина с PBX на 30 минут при комнатной температуре.

Затем удалите излишки PBX, коротко промыв срезы в PBT. После этого поместите пермеабилизированные срезы в 2 N HCl на 60 минут при комнатной температуре для депуринации ДНК. Затем перенесите срезы в 10 millimolar Tris-Hcl на 30 минут при комнатной температуре для нейтрализации HCl.

В качестве альтернативы промойте срезы трижды по пять минут в PBS. Инкубируйте срезы в PBT в течение пяти минут при комнатной температуре. После этого осторожно удалите жидкость из области вокруг срезов ткани.

Тем временем поддерживайте срезы ткани во влажном состоянии. Используя гидрофобный маркер, обведите срезы, не касаясь их. Затем инкубируйте срезы в 100 µL блокирующего раствора в течение одного часа при комнатной температуре в увлажненной камере.

Затем инкубируйте срезы ткани в 100 microliters разведения 1:5000 первичных моноклональных антител мыши против 5hmC и разведения 1:1000 первичных поликлональных антител кролика против 5caC в блокирующем растворе в течение одного часа при комнатной температуре. В качестве альтернативы проведите инкубацию в течение ночи при четырех градусах Celsius. Затем удалите избыток антител, промыв срезы в кювете Коплина с PBT три раза по пять минут при комнатной температуре.

Затем удалите излишки PBT и, если необходимо, снова обведите срезы гидрофобным барьерным маркером, так как PBT содержит детергент, который может ослабить гидрофобный барьер. После этого приготовьте разведение 1:400 козьих антител к кроличьим антителам, конъюгированных с HRP, и разведение 1:400 ослячьих антител к мышиным антителам, конъюгированных с 555, в блокирующем растворе. Затем инкубируйте срезы тканей в 100 microliters смеси вторичных антител в течение одного часа при комнатной температуре в увлажненной камере.

После этого промойте срезы ткани в стакане Коплина, наполненном PBT, трижды по пять минут при комнатной температуре. Затем перенесите срезы ткани в 100 µL тирамида в разведении 1:200 в буфере для усиления тирамидного сигнала на две минуты при комнатной температуре. Время инкубации в растворе тирамида следует оптимизировать экспериментально для каждой отдельной партии набора для усиления тирамидного сигнала, поскольку наблюдается линейная зависимость между интенсивностью сигнала и продолжительностью усиления сигнала на основе тирамида.

Сразу после этого удалите избыток раствора тирамида, промыв предметные стекла трижды по пять минут в PBT. Осторожно удалите остатки PBT и немедленно нанесите на срезы каплю Mounting medium. Аккуратно накройте срезы ткани покровным стеклом и зафиксируйте его с помощью лака для ногтей.

Затем выдержите срезы тканей при температуре четырех градусов Цельсия в течение нескольких часов перед микроскопическим исследованием. Для определения распределения 5hmC в срезах тканей мозга проводили совместную детекцию этой эпигенетической модификации с маркером постмитотических нейронов NeuN. Иммуногистохимический анализ показал, что в то время как выраженное окрашивание на 5hmC колокализовалось с NeuN-положительными клетками, NeuN-отрицательные глиальные клетки обладали более низкими уровнями геномного 5hmC.

Для определения распределения 5caC в дифференцирующихся нейральных стволовых клетках через три дня после индукции глиальной дифференцировки проводили совместное окрашивание этого маркера с глиальным маркером GFAP в фиксированных культурах нейральных стволовых клеток. В отличие от нейральных стволовых клеток или зрелых астроцитов, в большой части клеток, экспрессирующих GFAP, наблюдался сильный сигнал 5caC. При должном навыке выполнение данной методики при правильном подходе занимает около восьми часов.

При выполнении данной процедуры важно заранее подготовить все реагенты и материалы вместе с вашими образцами. После завершения этой процедуры можно провести конфокальную визуализацию, чтобы получить ответы на дополнительные вопросы о ядерном распределении модифицированных форм цитозина. Это может помочь в расшифровке их потенциальной биологической функции.

Не забывайте, что работа с 2 N HCl может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование вытяжного шкафа и защитной одежды.