Обнаружение измененных форм цитозина с использованием чувствительных иммуногистохимии

Общей целью данного иммунохимического протокола является оценка пространственного распределения модифицированных форм цитозина в различных тканевых и клеточных контекстах на основе использования пероксидазных конъюгированных вторичных антител и амплификации тирамидного сигнала. Этот метод преодолевает ограничения других методов, которые не предоставляют пространственной информации, необходимой для понимания биологической функции модифицированных форм цитозина. Кроме того, этот метод позволяет совместно детектировать модифицированные формы цитозина с маркерами белковой линии и может быть использован для изучения их ядерной локализации.

Чтобы начать эту процедуру, зафиксируйте регидратированные участки тканей эмбрионов мышей дикого типа CD1 и тканей мозга взрослого человека, поместив их в ледяную температуру 4% PFA или 4% FA на 15 минут при комнатной температуре. Затем удалите излишки фиксатора, промыв срезы в PBS в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем пропитайте срезы ткани, поместив их в банку Coplin, наполненную PBX, на 30 минут при комнатной температуре.

Затем удалите излишки АТС, коротко промыв секции в PBT. Теперь поместите проникающие участки в 2 Н HCl на 60 минут при комнатной температуре для депуринации ДНК. Затем перенесите срезы в 10 миллимолярный Tris-HCl на 30 минут при комнатной температуре, чтобы нейтрализовать HCl.

В качестве альтернативы промойте секции три раза по пять минут каждый в PBS. Инкубируйте секции в ПБТ в течение пяти минут при комнатной температуре. После этого аккуратно удалите жидкость из области, окружающей участки тканей.

Тем временем следите за тем, чтобы участки ткани были влажными. Используйте гидрофобную барьерную ручку, чтобы обвести секции, не касаясь их. Впоследствии инкубируйте секции в 100 микролитрах блокирующего раствора в течение одного часа при комнатной температуре во влажной камере.

Затем инкубируют срезы тканей в 100 микролитрах в разведении 1:5000 моноклонального первичного антитела мыши против 5hmC и в разведении 1:1000 поликлонального первичного антитела против 5caC кролика в блокирующем растворе в течение одного часа при комнатной температуре. В качестве альтернативы можно провести инкубацию в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Затем удалите излишки антител, промыв срезы в банке Coplin, наполненной PBT три раза по пять минут каждая при комнатной температуре.

Затем удалите излишки ПБТ и, при необходимости, снова обведите участки гидрофобной барьерной ручкой, так как ПБТ содержит моющее средство, которое может ослабить гидрофобный барьер. После этого сделайте разведение 1:400 козьего анти-кроличьего HRP-конъюгированного антитела и 1:400 1:400 конъюгированного антитела осла против мыши 555 в блокирующем растворе. Затем инкубируйте срезы тканей в 100 микролитрах вторичной смеси антител в течение одного часа при комнатной температуре во влажной камере.

После этого промойте срезы ткани в банке Coplin, наполненной PBT три раза по пять минут каждый при комнатной температуре. Затем переведите срезы ткани в 100 микролитров тирамида в соотношении 1:200 в буфере для усиления сигнала тирамида в течение двух минут при комнатной температуре. Время инкубации раствора тирамида должно быть оптимизировано экспериментально для каждой отдельной партии комплекта для усиления сигнала тирамидом, где наблюдается линейная зависимость между интенсивностью сигнала и продолжительностью усиления сигнала на основе тирамида.

Сразу после этого удалите излишки раствора тирамида, промыв предметные стекла три раза по пять минут каждая в ПБТ. Осторожно удалите излишки ПБТ и сразу же накройте секции каплей монтажной среды. Аккуратно наденьте покровный лист на участки ткани и заклейте покровный лист лаком для ногтей.

Затем держите срезы тканей при температуре четыре градуса Цельсия в течение нескольких часов перед микроскопическим исследованием. Для определения распределения 5hmC в срезах ткани мозга было проведено совместное обнаружение этой эпигенетической модификации с маркером для постмитотических нейронов NeuN. Иммуногистохимический анализ показал, что в то время как выраженное окрашивание 5hmC колокализуется с NeuN-положительными клетками, NeuN-отрицательные глиальные клетки обладают более низкими уровнями геномного 5hmC.

Для определения распределения 5caC в дифференцирующих нейральных стволовых клетках костейирование этого маркера проводили с помощью глиального маркера GFAP на фиксированных культурах нейральных стволовых клеток через три дня после индукции глиальной дифференцировки. В отличие от нейральных стволовых клеток или зрелых астроцитов, сильный сигнал 5caC наблюдался в значительной части клеток, экспрессирующих GFAP. После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за восемь часов, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что все реагенты и материалы вместе с образцами должны быть наготове. После этой процедуры может быть выполнена конфокальная визуализация, чтобы ответить на дополнительные вопросы о ядерном распределении модифицированных форм цитозина. Это может способствовать расшифровке их потенциальной биологической функции.

Не забывайте, что работа с 2 N Hcl может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как защитный шкаф и защитная одежда.