Визуализация и Количественное бесклеточной слоя в артериол мышцы крысы Кремастер

Общая цель данной процедуры заключается в количественной оценке пространственно-временных изменений ширины бесклеточного слоя in vivo. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микрогемодинамики, чтобы лучше понять роль целлюфилии в микроциркуляции. Основным преимуществом данного метода является то, что ширину целлюфилии in vivo можно определить более последовательно и удобно, чем с помощью предыдущих методов ручного измерения, которые требовали значительных временных затрат.

Перед началом измерения ширины бесклеточного слоя запустите предварительный скрипт MatLab для анализа бесклеточного слоя. Затем нажмите «open file», чтобы выбрать видеофайл для анализа, и с помощью ползунка вращения (rotation slide) выровняйте стенки одного сосуда по вертикали, при необходимости используя ползунок масштаба (zoom slide) для настройки уровня увеличения. Когда сосуд будет расположен правильно, нажмите «confirm editing», а затем нажмите «set ROI to crop» для определения области интереса.

Выровненное изображение будет отображено в сплывающем окне. При необходимости отрегулируйте положение прямоугольной области на изображении и дважды щелкните по ней, чтобы подтвердить выбранную область интереса. Затем нажмите «Extract Images», чтобы извлечь все отредактированные кадры видео в виде последовательных растровых изображений, которые будут сохранены в папке с тем же именем, что и выбранный видеофайл.

Чтобы измерить ширину бесклеточного слоя, нажмите «Select Folder» и выберите папку с изображениями. Первый кадр изображения появится в панели градаций серого вместе с соответствующей гистограммой интенсивности серого в панели гистограмм. Выберите из раскрывающегося списка нужный кадр для проведения анализа и нажмите «Find Vessel Walls», чтобы определить внутреннюю стенку сосуда на изображении; она определяется как место, где пик профиля интенсивности света переходит от темного к светлому на протяжении двух пикселей.

Отметьте «median filter», чтобы применить медианный фильтр к изображению для уменьшения шума типа «соль и перец». Отметьте «auto-contrast» для цифровой корректировки интенсивности изображения с целью повышения его контрастности. Затем выберите алгоритм бинаризации в раскрывающемся списке, чтобы автоматически определить пороговое значение, которое разделяет уровни серого на два класса: белые пиксели с уровнями серого выше порогового значения и черные пиксели с уровнями серого ниже порогового значения.

Чтобы измерить пространственную изменчивость ширины бесклеточного слоя, введите разрешение в пикселях в соответствующее поле. Затем нажмите «Calculate» (Рассчитать), чтобы получить данные о пространственной изменчивости ширины бесклеточного слоя, и нажмите «Export. csv», чтобы экспортировать данные о ширине бесклеточного слоя в табличном формате.

Чтобы измерить временную вариацию ширины бесклеточного слоя на определенной линии анализа вдоль сосуда, нажмите Temporal Variation и введите данные о частоте кадров. В полях start frame и last frame укажите соответственно номера первого и последнего кадров изображений для анализа. С помощью ползунка анализа настройте положение линии анализа вдоль сосуда и подтвердите его положение, как показано на сером и бинарном изображениях.

Затем нажмите Calculate, чтобы получить данные о временном изменении ширины бесклеточного слоя, и нажмите Export.csv, чтобы экспортировать данные о ширине бесклеточного слоя в табличном формате. Здесь показан типичный кровоток эритроцитов в неразветвленной артерии мышцы кремастера крысы, где бесклеточный слой наблюдается между ядром из эритроцитов и внутренней стенкой сосуда.

Хороший контраст между этими компонентами имеет решающее значение для обеспечения точности измерений ширины бесклеточного слоя. Начальный этап анализа изображений включал определение внутренней стенки сосуда. Положение стенки аппроксимируется по пику, на котором интенсивность света вдоль линии анализа, перпендикулярной сосуду, переходит от темного к светлому на протяжении двух пикселей.

Впоследствии границы ядер эритроцитов определяются с помощью алгоритма пороговой обработки изображений, после чего можно рассчитать ширину бесклеточного слоя (CFL). Поскольку эритроциты в бесклеточном слое обладают разной светопроницаемостью, различие в уровнях серого может быть разделено на два класса. Однако определение точного порогового значения между двумя пиками на гистограмме изображения может быть затруднено из-за низкого качества и контрастности изображения.

Для повышения контрастности между эритроцитами и бесклеточным слоем можно использовать синий фильтр. Это еще более заметно на данных изображениях, где границы ядер эритроцитов были определены более точно при использовании синего фильтра. Алгоритм пороговой обработки также может влиять на измерение ширины бесклеточного слоя, что видно на этих изображениях, где применение различных алгоритмов пороговой обработки привело к определению разных границ ядер эритроцитов и, следовательно, к различным значениям ширины бесклеточного слоя.

Измерение ширины бесклеточного слоя in vivo очень чувствительно к качеству изображений. Поэтому следует тщательно проводить хирургическую операцию и использовать подходящий оптический помощник для получения изображений высокого качества. Кроме того, крайне важно выбрать соответствующий алгоритм пороговой обработки изображений для обеспечения точного и согласованного измерения ширины бесклеточного слоя.