Оценка механизмов сосудистой контроля использования видео микроскопии изолированных сопротивления артериях крыс

Общая цель этой процедуры заключается в использовании изолированных артерий сопротивления для тестирования реактивности сосудов на вазоактивные стимулы. В нем также будет показано, как оценить изменения в механизмах контроля гладких мышц и пассивных механических свойствах. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области сосудистой биологии, касающиеся механизмов контроля эндотелиальных и сосудистых гладких мышц в артериях с малым сопротивлением при различных состояниях.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что артерии с малым сопротивлением могут быть изолированы от среды паренхиматозных клеток и поддерживаться на их нормальном давлении во время тестирования реакции на вазоактивные стимулы. Применение этого метода распространяется на терапию и диагностику сосудистой дисфункции. Этот вид манипуляции невозможен in vivo.

Хотя этот метод может дать представление о заболеваниях периферических сосудов, он также может быть применен при ишемической болезни сердца. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы микроканюляции трудно освоить из-за деликатности процедуры и необходимости избегать повреждения артерии. В день эксперимента приготовьте два литра физиологического раствора соли в двухлитровой колбе Эрленмейера.

При добавлении буферного запаса 20X следите за тем, чтобы раствор непрерывно уравновешивался с газовой смесью, и перемешивайте его с помощью магнитной мешалки. Затем следите за рН, добавляя в смесь 0,28 грамма мононатрийфосфата. При необходимости очистите pH от пыли, добавив капли либо шести нормальных соляных кислот, либо 6,5 обычного раствора гидроксида натрия из дозатора так, чтобы pH оставался на уровне 7,4.

Затем добавьте в физиологический раствор соли 1,98 грамма глюкозы. Далее приготовьте 500 миллилитров физиологического раствора соли без кальция, разбавив исходный раствор 20X в деионизированной воде. Затем добавьте 25 миллилитров буферного запаса 20X в колбу Эрленмейера и добавьте в раствор 0,07 грамма монофосфата натрия, контролируя и регулируя pH раствора.

Используйте трубку тетрафторэтилена для подключения газового баллона, содержащего соответствующую газовую смесь, к ванне для органов. Непрерывно пузырьки раствора со скоростью, достаточной для обеспечения непрерывного, но не турбулентного барботирования раствора, поступающего в камеру сосуда. Кроме того, поместите небольшой воздушный камень, подключенный к уравновешивающей газовой смеси, в камеру сосуда, чтобы помочь сохранить газовый состав физиологического раствора соли.

Поместите физиологический раствор соли в двухлитровую бутылку Mariotte. Добавьте центральную стеклянную трубку к пробке, которая будет служить резервуаром, который будет непрерывно доставлять физиологический раствор соли в фармакологическую ванну органа, которая подает раствор в камеру сосуда. Поместите отверстие центральной стеклянной трубки в бутылке Мариотта на том же уровне, что и верх физиологического раствора соли в органной ванне.

Это обеспечит постоянное гидростатическое давление напора для подачи физиологического раствора соли в органную ванну. Используйте полиэтиленовую трубку, соединенную с J-образной стеклянной трубкой, чтобы доставить физиологический раствор соли из бутылки Мариотта в ванну для органов. Для обильного просвета используйте полиэтиленовую трубку, чтобы подключить входную пипетку к физиологическому резервуару для раствора соли, состоящему из пластикового шприца объемом 66 куб. см, поднятого в положение, поддерживающее желаемое давление притока.

Контролируйте давление, подключив датчик давления к системе через запорный кран. Затем подсоедините пипетку для оттока к полиэтиленовой трубке к резервуару, аналогичному резервуару для притока, чтобы физиологический раствор соли мог протекать через сосуд в ответ на градиент давления. Кроме того, используйте аналогичное соединение запорного крана и датчика давления для контроля давления на выходе.

Извлеките мозг крысы Спрэг Доули и поместите его в лежачее положение в стеклянную чашку Петри, наполненную ледяным физиологическим раствором соли. Затем поставьте тарелку под стереоскоп. Используйте ножницы Vannas и щипцы Dumont номер пять с тонким наконечником, чтобы вырезать средние мозговые артерии из мозга.

Затем очистите остатки мозговой ткани от средней мозговой артерии с помощью щипцов. Перенесите артерию в камеру сосуда, аккуратно придерживая ее за конец иссеченного сегмента, и осторожно поместите в камеру. Затем проденьте мозговую артерию на входящую микропипетку, потягивая ее к основанию пипетки до тех пор, пока кончик не продвинется в просвет артерии.

Закрепите артерию на входящей пипетке, обвязав петлю, приготовленную из одноцепочечного волокна, предварительно затянутого из 10-0 швов вокруг артерии. Затем закрепите противоположный конец средней мозговой артерии на выходной пипетке, затянув вторую шовную петлю вокруг сосуда, и с помощью микрометра, подключенного к держателю входящей пипетки, растяните артерию до длины in situ. Перевяжите все боковые ветви с помощью одиночных нитей, защипнутых из 10-0 швов, чтобы поддерживать постоянное давление в артерии.

Затем установите видеомикроскоп, состоящий из видеокамеры, прикрепленной к препарирующему микроскопу, который подключен к видеомикрометру и телевизионному монитору. Используйте эту установку для измерения внутреннего диаметра артерии. Оцените миогенный тонус и реакцию сосудов на сосудорасширяющие стимулы, убедившись, что артерия демонстрирует подходящий уровень активного тонуса до начала эксперимента.

Откажитесь от всех артерий, лишенных активного тонуса в состоянии покоя, за исключением сосудов, таких как небольшие брыжеечные артерии, которые обычно не демонстрируют активный тонус в состоянии покоя. Затем добавьте возрастающие концентрации ацетилхолина в камеру сосуда и измерьте диаметр сосуда, чтобы проверить эндотелий-зависимую реактивность канюлированной артерии сопротивления. В этом примере артерия демонстрирует эндотелиальную дисфункцию, о чем свидетельствует ее неспособность расширяться в ответ на ацетилхолин.

В конце эксперимента определяют максимальный диаметр артерии, добавляя в перфузат и суперфузат физиологический раствор соли, не содержащий кальция. Используйте это измерение для расчета процента активного тона покоя. Демонстрация максимальной дилатации в физиологическом растворе соли без кальция подтверждает, что неспособность артерии расширяться в ответ на ацетилхолин была вызвана эндотелиальной дисфункцией, а не неспособностью артерии расслабляться из-за структурного ремоделирования сосуда.

На этом рисунке показана реакция на эндотелий-зависимый вазодилататор ацетилхолин в изолированных средних церебральных артериях у самцов крыс Dahl Salt Sensitive в трех суженных конгенных штаммах. Это показывает, что эндотелий-зависимая дилатация до ацетилхолина отсутствовала у чувствительного к соли родительского штамма и у обоих конгенных штаммов, сохраняющих чувствительный к соли аллель Ренана. Нормальная дилатация была восстановлена у конгенного штамма, несущего коричневый аллель Renan Norway в солечувствительном генетическом фоне, что подтверждает гипотезу о том, что эндотелиальная дисфункция у крыс SS обусловлена нарушением регуляции гена Renan.

В этом эксперименте неспособность диеты с высоким содержанием соли устранить эндотелий-зависимое расширение до ацетилхолина у одного конкретного штамма крыс, результаты относительно факторов, способствующих сосудистому окислительному стрессу и эндотелиальной дисфункции при повышении потребления соли с пищей. После освоения этой техники ее можно выполнить за три-три с половиной часа, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о очень осторожном обращении с изолированной артерией, чтобы избежать повреждения гладкой мускулатуры и особенно эндотелия.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как добавление вазоконстрикторов и вазодилататоров или антагонистов рецепторов, чтобы ответить на вопросы, включая механизмы, влияющие на сосудистую реактивность на различные вещества и механизмы действия лекарств на кровеносные сосуды. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области сосудистой биологии и микроциркуляторной физиологии для изучения гладких мышц и функции эндотелия в артериях сопротивления из различных сосудистых русла экспериментальных животных и человека. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать этот метод для оценки механизмов контроля эндотелиальных и сосудистых гладких мышц в артериях с малым сопротивлением из разных сосудистых русла.