Индуцированные плюрипотентные поколение стволовых клеток из клеток крови с помощью вируса Сендай и центрифугирование

Общая цель данного исследования заключается в перепрограммировании мононуклеарных клеток периферической крови в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки с использованием серийного осаждения методом центрифугирования. Первоначально ИПСК генерировались путем перепрограммирования фибробластов. Сегодня для перепрограммирования используются различные.

Тем не менее, из-за доступности крови, PBMC могут быть неприемлемым источником клеток для дальнейшего применения iPSCs, скрининга лекарств, моделирования диссертаций и разработки регенеративной медицины. В рамках исследования мы поделимся протоколом о перепрограммировании iPSC с использованием PBMC путем добавления центробежной силы. Этот протокол предоставит еще одну возможность при перепрограммировании плавающих ячеек.

Для демонстрации процедуры мы будем использовать Нама, аспиранта из моей лаборатории. Чтобы изолировать моноцитарные клетки, сначала получите не менее десяти миллилитров свежей крови из забора крови в пробирке для подготовки клеток. Далее переложите кровь в новую 50-миллилитровую коническую пробирку и разведите ее стерилом PBS в соотношении один к четырем.

После этого добавьте десять миллилитров градиентной среды в новую 50-миллилитровую коническую пробирку и тщательно налейте разбавленную кровь поверх градиентной среды. Затем центрифугируйте образец при 750-кратном избежании в течение 30 минут при комнатной температуре, без перерыва на центрифугирование. Через 30 минут аккуратно переложите баффовый слой в новую 50-миллилитровую коническую трубку.

Добавьте 30 миллилитров PBS, и промойте клетки. Затем центрифугируйте клетки при 515 умноженных на g в течение пяти минут при комнатной температуре. После этого откажитесь от PBS и повторно суспендируйте клетки в 0,5 миллилитрах среды для клеток крови.

После этого подсчитайте ячейки и поместите их в 24-луночный планшет. Добавьте PBS в окружающие лунки, чтобы предотвратить испарение. После этого стабилизируйте клетки в течение пяти дней при температуре 37 градусов Цельсия перед трансдукцией.

Добавьте дополнительно 0,5 миллилитра свежей среды для клеток крови на третий-четвертый день, не нарушая клетки. При этой процедуре клетки крови переносят в 15-миллилитровую коническую пробирку, и подсчитывают их с помощью гемацитометра. Затем трижды от десяти до пятой клетки подготовьте к трансдукции и центрифугируйте клетки при 515 умноженных на g в течение пяти минут при комнатной температуре.

После этого отбросьте надосадочную жидкость путем отсасывания и ресуспендируйте клетки в 0,5 миллилитрах среды для клеток крови. Затем переложите ячейки в лунку из 24-луночной пластины без покрытия. Разморозьте смесь вируса Сендай во льду, и добавьте ее во взвешенные клетки.

Запечатайте пластину герметизирующей пленкой, и центрифугируйте ее при 1,150 g в течение 30 минут при 30 градусах Цельсия. После центрифугирования инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе в течение ночи. Чтобы покрыть 24-луночный планшет витронектином, на следующий день разведите раствор витронектина в PBS до получения конечной концентрации в пять микрограммов на миллилитр.

Далее добавьте в лунку один миллилитр витронектина, и выдержите его при комнатной температуре, не менее одного часа. После этого удалите раствор для покрытия и перенесите все среды, содержащие клетки и вирус, в лунку с покрытием. Затем соберите оставшиеся клетки с дополнительными 0,5 миллилитрами свежей среды для клеток крови и добавьте ее в ячейкосодержащую лунку.

Затем центрифугируйте планшет при 1150 g в течение десяти минут при 35 градусах Цельсия, а затем поддерживайте клетки при 37 градусах Цельсия в 5% углекислом газе в течение ночи. Для переноса вторых клеток покройте лунку витронектином с пятью микрограммами на миллилитр, как описано ранее. Используйте одну лунку планшета для каждой трансдукции и перенесите клеточную суспензию с первой пластины на пластину с новым покрытием из витронектина.

Тем временем добавьте один миллилитр среды iPSC в лунку первой пластины для обслуживания и инкубируйте ее при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе, с ежедневной заменой среды на свежую среду iPSC. Колонии появятся с 14 по 21 день, после трансдукции. Центрифугируйте пластину с новым покрытием, содержащую взвешенные элементы, при температуре 1,150 g при 35 градусах Цельсия в течение десяти минут.

После центрифугирования инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе в течение ночи. На следующий день удалите надосадочную жидкость и замените ее свежей индуцированной плюрипотентной средой стволовых клеток. Поддерживайте прикрепленные ячейки с ежедневной сменой среды до тех пор, пока не будет достигнуто 80% слияние.

За неделю до сбора колоний посейте один раз по десять-четвертую клетки в 100-миллиметровой чашке, покрытой витронектином. Далее приготовьте покрытое витронектином 60-миллиметровое блюдо, добавив два миллилитра раствора витронектина, и выдержите его при комнатной температуре не менее одного часа. Наблюдая через микроскоп, отметьте колонии на нижней части пластины четкими границами с помощью маркера.

Удалите раствор витронектина из новой пластины и добавьте шесть миллилитров индуцированной плюрипотентной среды стволовых клеток, дополненную десятью миллимолярами RHO-киназой. Впоследствии удалите питательную среду из клеток, и промойте их тремя миллилитрами PBS. Затем добавьте один миллилитр раствора для отделения колонии iPSC и инкубируйте их в течение 30 секунд при комнатной температуре.

После этого достаньте раствор из тарелки, и выдержите его при комнатной температуре еще 30 секунд. Через 30 минут наберите 200 микролитров среды из планшета и отделите целевые колонии с помощью пипетирования. Затем пересадите разбросанные колонии в новую 60-миллиметровую тарелку.

Инкубируйте и поддерживайте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе до тех пор, пока они не достигнут десятого прохода. На ранней стадии перепрограммирования иПСК смешивали с прикрепленными неперепрограммированными дифференцированными клетками. До экспансии ИПСК и другие клетки отличались для различения.

Путем засеивания клеток с низкой плотностью были получены колонии, которые были достаточно большими для пикировки. После выделения колонии клеточные скопления были диссоциированы на отдельные клетки, и культура. После этого были обнаружены чистые колонии iPSC.

После того, как чистые индуцированные плюрипотентные стволовые клетки расширились, качество клеток было проверено. Клетки окрашивали щелочной фосфатазой для подтверждения недифференцированного состояния индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Все колонии, полученные из выделенных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, показали положительное окрашивание.

Плюрипотентные маркеры были подтверждены иммунофлуоресцентным окрашиванием. У перепрограммированных клеток высокоэкспрессируемых плюрипотентных маркеров, таких как SSEA4, Oct4, Sox2, TRA-1-81, Klf4 и, самое главное, TRA-1-60, экспрессия плюрипотентных маркеров была подтверждена RTPCR. Используя последовательное нанесение покрытий центрифугированием, крепление транзитора с помощью PBMC на пластину с метрическим покрытием.

Атташе там находятся как положено, а колонии iPSC повторяются для очищения. Используя этот протокол, iPSC может быть сгенерирован из PBMC в течение месяца. Этот протокол сокращает время, необходимое для прикрепления трансдуцированных клеток, и предотвращает потерю перепрограммированных клеток, которые не смогли прикрепиться самостоятельно.

Тем не менее, очистка полностью перепрограммированных колониеобразующих ИПСК может иметь решающее значение при попытке проведения этой процедуры. Ранее мы успешно перепрограммировали PBMC и мононуклеарные элементы с использованием этого протокола. Полученные из клеток крови iPC могут быть широко использованы в различных областях исследований.

Этот протокол может помочь в процессе перепрограммирования других типов элементов с плавающей суспензией для дальнейшего применения и исследований.