Эффективная генерация человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из человеческих соматических клеток с Сендай-вируса

Общей целью этой процедуры является получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека с вирусом Сендай. Это достигается путем предварительной подготовки и нанесения покрытия клеток фибробластов, подлежащих трансдуцированию. Следующим этапом процедуры является заражение клеток вирусом Сендай

Затем инфицированные клетки фибробластов переводятся на свежие эмбриональные клетки-фидеры фибробластов мыши. Последним шагом является ручной выбор перепрограммированных. Теперь плюрипотентные стволовые клетки, в конечном итоге перепрограммирование клеток фибробластов в I ПСК без использования трансгенов, могут быть показаны с помощью иммуномаркировки и R-T-P-C-R.

Основное преимущество этого метода перед существующим методом заключается в том, что он повышает эффективность перепрограммирования без сохранения транзита и экономически эффективным способом. С помощью FBS эти клетки переносят в 24-луночные планшеты для экспериментальной пластины в шести последовательных разведениях, чтобы определить наилучшую плотность для прикрепления клеток. Каждый ряд 24-луночной пластины может вместить одну серию ячеек для разведения.

Таким образом, четыре типа клеток можно протестировать на одном планшете, инкубировать разведенный раствор в течение 24 часов. На следующий день отбирают лунки на трех уровнях слияния для трансдукции. Один при высоком уровне конфлюенции от 80 до 90%, другой при примерно 60% конфлюенции, а третий при примерно 30% конфлюенции за час или более до трансдукции.

Замените среду на 300 микролитров свежей среды фибробластов для трансдукции оттаивания. Один комплект сендайских вирусных пробирок при температуре 37 градусов Цельсия в течение нескольких секунд, а затем закончить. Размораживание их при комнатной температуре.

Центрифугируйте размороженные вирусы при температуре 6 000 G в течение 10 секунд и храните их на льду в одной микроцентрифужной пробирке. Составьте смесь вирусов, рассчитанную в соответствии с количеством клеток, подлежащих трансдуцированию. Детали расчета можно найти в текстовом протоколе.

Хорошо перемешайте вирусы с помощью аккуратного пипетирования. Теперь к максимально плотным клеткам добавьте два объема вируса. Добавьте один объем вируса к клеткам средней плотности и добавьте половину объема вируса к наименее плотному выделению.

Переверните тарелку и дайте ей инкубироваться в течение ночи, чтобы реакция произошла на следующий день. Замените среду 500 микролитрами свежей фибробластной среды. Проделайте это снова через два дня, через три дня после второго изменения среды в трансдуцированных клетках.

Приготовьте метамфетаминовые клетки в 60-миллиметровых чашках с DMEM, содержащим 10% FBS, 500 000 клеток на чашку и инкубируйте их в течение ночи. На следующий день замените среду на клетках метамфетамина свежей средой, а затем приступайте к настройке совместного культивирования. Сначала удалите среду из трансдуцированных фибробластов и промойте их один раз с помощью DPBS.

Затем добавьте 200 микролитров 0,25% трипсина ЭДТА в каждую трансдуцированную лунку клеток в течение пяти минут. Объедините все отделяющиеся клетки в одну коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Поворачивайте ячейки при 1,350 G в течение четырех минут.

Затем удалите надосадочную жидкость и промойте гранулированные клетки примерно пятью миллилитрами свежей среды, чтобы нейтрализовать триппин. Теперь собираем ячейки еще одним четырехминутным вращением на 1, 350 G. Следующая пластина. Большинство клеток в виде шести серийных разведений в метамфетамине.

Первое и последнее разведения могут не понадобиться в зависимости от смертности клеток. Сохраните некоторые клетки для извлечения РНК и инкубируйте планшеты в течение ночи. На следующий день замените среду на человеческие ЭС среды с добавлением 10 микромоляров ингибитора RO-киназы Y 2 7 6 3 2.

Чтобы улучшить выживаемость клеток в течение последующих дней, замените среду на нормальную, дополненную человеческим ЭС средой. После недели культивирования начните проверять чашки каждые несколько дней на предмет образования колоний ES, похожих на клеточные скопления. Как только они появятся, следите за ростом.

Через три недели после трансдукции колонии скоплений ЭС клеток должны быть готовы к экспансии. Подготовьте ячейки питателя метамфетамина в 24 луночных планшетах так же, как они были подготовлены для 60-миллиметровых пластин. Перед тем, как выбрать какие-либо колонии, смените среду на метамфетаминовых клетках на среду ES с 10 микролитрами Y2 7, 6, 3, 2.

Выбирайте по одной колонии из посуды. Переложите колонию в 15-миллилитровую трубку с раствором там. Разбейте колонию с помощью пипетки.

Затем накройте одного меня. Ну и с разбитой колонией. В конечном итоге загрузите каждую скважину одной разбитой колонией и загрузите как можно больше скважин.

Поддерживайте клетки с ежедневной сменой сред и расширяйте их до шести луночных тарелок и затем 60-миллиметровых посуд. Как правило, фибробласты, инфицированные вирусом Сендай, не проявляют никаких морфологических изменений в течение пяти дней. Затем клетки приобретают круглую форму с более крупным ядром и меньшей цитоплазмой.

Этот мелкомасштабный протокол включает в себя несколько параметров, которые можно оптимизировать, таких как плотность фибробластов, титр вирусов и плотность покрытия по MES. Также может быть оптимизирована трансдукция клеток с разной беглостью, отображаемая разными цветами. После недели совместной культивирования с клетками, питающимися метамфетамином, частично перепрограммированные фибробласты имеют рыхлую форму и легко выбираются, в отличие от сбора с помощью трипсина.

Полностью перепрограммированные, I-ПСК можно четко отличить от частично перепрограммированных ячеек. Полностью перепрограммированные клетки плотно упакованы, и колонии могут иметь четкие границы. Частично перепрограммированные ячейки образуют рыхлые кластеры, которые легко отделяются.

После расширения клонов IPSC в течение нескольких недель, окрашивание на маркеры стволовых клеток оправдано по сравнению с клетками H nine. ИПК положительны на несколько ожидаемых антител, включая SSEA 4, OCT 4, TRA 81 и nano G, что поддерживает их плюрипотентное качество. Использование экспрессии трансгена R-T-P-C-R не отмечено у клонов IPSC человека.

После 10 праймеров для экзогенной ОКТ 4, SOX 2, klf 4 и Cmic использовали с положительными контрольными образцами, которые показали высокие уровни экспрессии трансгенов. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как перепрограммировать соматические клетки для индуцирования полипотентных стволовых клеток и как выбрать их, полностью перепрограммировать клетки из других клеток.