Вазодилатацию изолированных судов и Изоляция внеклеточного матрикса мышей Плотно кожи

Общей целью этих процедур выделения внеклеточного матрикса и вазодилатации ex vivo является изучение лечения ингибиторными пептидами IRF5 у грызунов. Этот метод может помочь ответить на вопрос о том, как изменения во внеклеточном матриксе могут усиливать или ослаблять прогрессирование заболевания. Основное преимущество исследований вазодилатации заключается в том, что они дают нам представление о процессах in vivo без необходимости принимать во внимание все сигнальные компоненты.

Выделение сердечного внеклеточного матрикса может быть применено к другим органам, таким как задние конечности или легкие. Впервые у нас появилась эта идея, когда мы начали фокусироваться на дупликации фибриллина 1 у мышей с плотной кожей и осознали влияние измененного внеклеточного матрикса и поведения клеток. После обезболивания мыши и подготовки ее к операции вскройте кожу с помощью ножниц.

Разрез от груди к боковой кости челюсти с осторожностью, чтобы не повредить подлежащие ткани в направлении передней части челюсти. Затем рассеките фасциальную артерию, удалив мягкие ткани вокруг нее. При этом будьте осторожны, чтобы не повредить артерию.

Окуните открытые ткани в буфер для швабр, чтобы они оставались здоровыми. После того, как фасциальная артерия будет полностью обнажена, захватите фасциальную артерию проксимальнее первой бифуркации дистальнее того места, где будет перерезана артерия. Затем отрежьте его от родительской артерии и возьмитесь за фасциальную артерию щипцами.

Отрежьте две ветви, отходящие от фасции, а затем осторожно поднимите сосуд, разрывая соединения с окружающими тканями до тех пор, пока не будет достигнута бифуркация. При раздвоении перережьте обе дочерние артерии, чтобы освободить сосуд, и перенесите его в чашку с буфером для швабры, где он будет оставаться увлажненным до тех пор, пока он не понадобится. Чтобы измерить вазодилатацию, сначала подготовьтесь к канюляции сосудов.

Загрузите стеклянные пипетки с диаметром клеммы от 125 до 175 микрон, наполненные буфером для швабры. Также заполните резервуары с раствором швабрами. Теперь канюльизируйте изолированные сосуды.

Завяжите их на стеклянные пипетки с помощью офтальмологического шва. Обязательно следите за тем, чтобы в пипетках не образовывались пузырьки воздуха. Далее смонтируйте камеры сосудов на перевернутом микроскопе с помощью видеокамеры.

Пропустите видео через систему измерения видеоштангенциркуля для измерения сосудов на экране. Теперь нагнетайте давление в сосудах с помощью двухэтапного процесса. Сначала поднимите швабрами наполненные резервуары на высоте над сосудом на 20 миллиметров ртутного столба давления.

Откройте линию со швабрами к судну. По мере того, как сосуд нагнетает давление, ищите признаки утечки вокруг шпал и по всей длине судна. Если утечек не обнаружено, поднимите резервуары, чтобы создать давление 60 миллиметров ртутного столба.

Затем еще раз осмотрите сосуды на предмет течи. Как только давление будет поддерживаться без утечек, уравновесьте сосуд в течение 30 минут при этом давлении. После того, как состояние равновесия, измерьте вазодилатацию в ответ на процентное соединение.

Сначала сужьте судно от половины до трех четвертей, добавив U46619. Дайте раствору искупать сосуды в течение шести минут для стабилизации. Затем постепенно добавляйте в ванну испытуемый состав, такой как ацетилхолин.

Каждые две минуты увеличивайте концентрацию исследуемого раствора в ванне на 10, начиная с 000001 моляра и заканчивая 001 моляром. Изменения в расширении сосудов подняли вопросы о передаче сигналов. Но наше внимание сосредоточено на сердце.

Чтобы сократить использование препарата животными, мы решили изолировать сердечный внеклеточный матрикс, чтобы сосредоточиться на сигнализации, инициируемой извне. Начните со забора сердца у мыши, находящейся под наркозом. Переложите его в стакан, загруженный 15 миллилитрами гипертонического однопроцентного додецилсульфата натрия.

Держите раствор, осторожно помешивая, на тарелке для перемешивания при комнатной температуре в течение 18 часов. На следующий день измените раствор на 15 миллилитров 5-процентного тритона X100 на 30 минут, а затем на 15 миллилитров PBS на 15 минут. Затем заморозьте ЭВМ и жидкий азот в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитров

После застывания, переложите ткань в предварительно охлажденную ступку и измельчите ее в порошок. Суспендировать порошок в PBS с добавлением антибиотика в концентрации 1:100 в вязком растворе. Обрабатывайте суспензию ультразвуком в течение 30-60 секунд в ледяной бане при высокой настройке ультразвука.

Белок ВКМ в настоящее время изолирован и должен оставаться холодным. Перед употреблением белка измерьте его концентрацию с помощью анализа Брэдфорда. Пептид IRF5D является ингибирующим пептидом, который сильно отличается от нормального IRF5.

IRF5D содержит всего 17 аминокислот и связывается с сайтом фосфорилирования IRF5. Это предотвращает фосфорилирование и гомодимеризацию, тем самым препятствуя образованию активного состояния IRF5. Гетерозиготные мыши с плотной кожей получали IRF5D подкожно в течение трех недель.

Количество нейтрофилов и CD64 снижалось по данным иммуногистохимии в среднем числе окрашенных клеток на поле зрения. Лечение IRF5D улучшило индуцированную ацетилхолином вазодилатацию артерий фасциалиса у гетерозиготных мышей с плотной кожей, получавших IRF5D, по сравнению с теми, кто получал фосфатный буфер. В культивируемых миоцитах, полученных из сердечной ткани трансгенных мышей, было больше IRF5-положительных клеток в культурах гетерозиготных мышей с плотной кожей, чем у контрольных мышей.

Обработка любой культуры IRF5D приводила к снижению IRF5-положительных ядер. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как провести децеллюляризацию сердца. После освоения эта техника может быть перенесена на многие органы и поможет ответить на самые разные вопросы.

Вы также должны хорошо понимать, как рассекать и навешивать фасциальную артерию. После освоения этой техники это должно занять около 60 минут и может быть использовано практически на любом сосудистом русле. Важно помнить, насколько хрупким является эндотелий, действовать с осторожностью во время вскрытия.

Нередки случаи наличия здоровой гладкой мускулатуры и поврежденного эндотелия.