Вазодилатацию изолированных судов и Изоляция внеклеточного матрикса мышей Плотно кожи
24 марта 2017 г.
Мы описываем выделение сердечного внеклеточного матрикса у контрольных мышей C57Bl/6J, мышей с плотной кожей и мышей с плотной кожей, обработанных ингибирующим пептидом IRF5. Мы также описываем исследования вазодилатации изолированных сосудов от C57Bl/6J, мышей с плотной кожей и мышей с плотной кожей, получавших ингибиторный пептид IRF5.
Общей целью этих процедур выделения внеклеточного матрикса и вазодилатации ex vivo является изучение лечения ингибиторными пептидами IRF5 у грызунов. Этот метод может помочь ответить на вопрос о том, как изменения во внеклеточном матриксе могут усиливать или ослаблять прогрессирование заболевания. Основное преимущество исследований вазодилатации заключается в том, что они дают нам представление о процессах in vivo без необходимости принимать во внимание все сигнальные компоненты.
Выделение сердечного внеклеточного матрикса может быть применено к другим органам, таким как задние конечности или легкие. Впервые у нас появилась эта идея, когда мы начали фокусироваться на дупликации фибриллина 1 у мышей с плотной кожей и осознали влияние измененного внеклеточного матрикса и поведения клеток. После обезболивания мыши и подготовки ее к операции вскройте кожу с помощью ножниц.
Разрез от груди к боковой кости челюсти с осторожностью, чтобы не повредить подлежащие ткани в направлении передней части челюсти. Затем рассеките фасциальную артерию, удалив мягкие ткани вокруг нее. При этом будьте осторожны, чтобы не повредить артерию.
Окуните открытые ткани в буфер для швабр, чтобы они оставались здоровыми. После того, как фасциальная артерия будет полностью обнажена, захватите фасциальную артерию проксимальнее первой бифуркации дистальнее того места, где будет перерезана артерия. Затем отрежьте его от родительской артерии и возьмитесь за фасциальную артерию щипцами.
Отрежьте две ветви, отходящие от фасции, а затем осторожно поднимите сосуд, разрывая соединения с окружающими тканями до тех пор, пока не будет достигнута бифуркация. При раздвоении перережьте обе дочерние артерии, чтобы освободить сосуд, и перенесите его в чашку с буфером для швабры, где он будет оставаться увлажненным до тех пор, пока он не понадобится. Чтобы измерить вазодилатацию, сначала подготовьтесь к канюляции сосудов.
Загрузите стеклянные пипетки с диаметром клеммы от 125 до 175 микрон, наполненные буфером для швабры. Также заполните резервуары с раствором швабрами. Теперь канюльизируйте изолированные сосуды.
Завяжите их на стеклянные пипетки с помощью офтальмологического шва. Обязательно следите за тем, чтобы в пипетках не образовывались пузырьки воздуха. Далее смонтируйте камеры сосудов на перевернутом микроскопе с помощью видеокамеры.
Пропустите видео через систему измерения видеоштангенциркуля для измерения сосудов на экране. Теперь нагнетайте давление в сосудах с помощью двухэтапного процесса. Сначала поднимите швабрами наполненные резервуары на высоте над сосудом на 20 миллиметров ртутного столба давления.
Откройте линию со швабрами к судну. По мере того, как сосуд нагнетает давление, ищите признаки утечки вокруг шпал и по всей длине судна. Если утечек не обнаружено, поднимите резервуары, чтобы создать давление 60 миллиметров ртутного столба.
Затем еще раз осмотрите сосуды на предмет течи. Как только давление будет поддерживаться без утечек, уравновесьте сосуд в течение 30 минут при этом давлении. После того, как состояние равновесия, измерьте вазодилатацию в ответ на процентное соединение.
Сначала сужьте судно от половины до трех четвертей, добавив U46619. Дайте раствору искупать сосуды в течение шести минут для стабилизации. Затем постепенно добавляйте в ванну испытуемый состав, такой как ацетилхолин.
Каждые две минуты увеличивайте концентрацию исследуемого раствора в ванне на 10, начиная с 000001 моляра и заканчивая 001 моляром. Изменения в расширении сосудов подняли вопросы о передаче сигналов. Но наше внимание сосредоточено на сердце.
Чтобы сократить использование препарата животными, мы решили изолировать сердечный внеклеточный матрикс, чтобы сосредоточиться на сигнализации, инициируемой извне. Начните со забора сердца у мыши, находящейся под наркозом. Переложите его в стакан, загруженный 15 миллилитрами гипертонического однопроцентного додецилсульфата натрия.
Держите раствор, осторожно помешивая, на тарелке для перемешивания при комнатной температуре в течение 18 часов. На следующий день измените раствор на 15 миллилитров 5-процентного тритона X100 на 30 минут, а затем на 15 миллилитров PBS на 15 минут. Затем заморозьте ЭВМ и жидкий азот в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитров
.После застывания, переложите ткань в предварительно охлажденную ступку и измельчите ее в порошок. Суспендировать порошок в PBS с добавлением антибиотика в концентрации 1:100 в вязком растворе. Обрабатывайте суспензию ультразвуком в течение 30-60 секунд в ледяной бане при высокой настройке ультразвука.
Белок ВКМ в настоящее время изолирован и должен оставаться холодным. Перед употреблением белка измерьте его концентрацию с помощью анализа Брэдфорда. Пептид IRF5D является ингибирующим пептидом, который сильно отличается от нормального IRF5.
IRF5D содержит всего 17 аминокислот и связывается с сайтом фосфорилирования IRF5. Это предотвращает фосфорилирование и гомодимеризацию, тем самым препятствуя образованию активного состояния IRF5. Гетерозиготные мыши с плотной кожей получали IRF5D подкожно в течение трех недель.
Количество нейтрофилов и CD64 снижалось по данным иммуногистохимии в среднем числе окрашенных клеток на поле зрения. Лечение IRF5D улучшило индуцированную ацетилхолином вазодилатацию артерий фасциалиса у гетерозиготных мышей с плотной кожей, получавших IRF5D, по сравнению с теми, кто получал фосфатный буфер. В культивируемых миоцитах, полученных из сердечной ткани трансгенных мышей, было больше IRF5-положительных клеток в культурах гетерозиготных мышей с плотной кожей, чем у контрольных мышей.
Обработка любой культуры IRF5D приводила к снижению IRF5-положительных ядер. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как провести децеллюляризацию сердца. После освоения эта техника может быть перенесена на многие органы и поможет ответить на самые разные вопросы.
Вы также должны хорошо понимать, как рассекать и навешивать фасциальную артерию. После освоения этой техники это должно занять около 60 минут и может быть использовано практически на любом сосудистом русле. Важно помнить, насколько хрупким является эндотелий, действовать с осторожностью во время вскрытия.
Нередки случаи наличия здоровой гладкой мускулатуры и поврежденного эндотелия.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается выделение сердечного внеклеточного матрикса из различных моделей мышей и последующие исследования вазодилатации. Основное внимание уделено изучению влияния терапии ингибирующим пептидом IRF5 на прогрессирование заболевания.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология сердечно-сосудистой системы
- Исследования внеклеточного матрикса
Обзор
- Изоляция внеклеточного матрикса имеет решающее значение для изучения его роли при заболеваниях.
- IRF5 участвует в прогрессировании некоторых заболеваний.
- У мышей линии Tight-skin наблюдаются измененные свойства внеклеточного матрикса.
- Исследования вазодилатации позволяют получить представление о функции сосудов.
Цель исследования
- Для выделения внеклеточного матрикса сердца для дальнейшего анализа.
- Для оценки влияния ингибирующего пептида IRF5 на сосудистые реакции.
- Для понимания того, как изменения внеклеточного матрикса влияют на прогрессирование заболевания.
Используемые методы
- Выделение сердечного внеклеточного матрикса из моделей мышей.
- Исследования вазодилатации ex vivo на изолированных сосудах.
- Сравнение ответов между контрольной группой и мышами, прошедшими лечение.
- Хирургическая подготовка мышей для выделения матрикса.
Основные результаты
- Успешное выделение внеклеточного матрикса сердца у мышей различных линий.
- Ответы вазодилатации различались у контрольных мышей и мышей, получавших пептид IRF5.
- Получены новые данные о роли внеклеточного матрикса в функционировании сосудов.
- Возможность применения данного метода выделения для других органов.
Выводы
- Данное исследование подчеркивает важность внеклеточного матрикса для здоровья сердечно-сосудистой системы.
- Терапия с использованием ингибирующего пептида IRF5 демонстрирует перспективность в модуляции сосудистых реакций.
- Необходимы дальнейшие исследования для изучения возможностей применения этих данных при лечении заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для отрасли
Данный метод позволяет снизить механистические риски при выборе IRF5 в качестве терапевтической мишени, связывая ремоделирование внеклеточного матрикса с сосудистой дисфункцией при воспалительном фиброзе. Тест на вазодилатацию ex vivo обеспечивает количественные, воспроизводимые показатели функции эндотелия независимо от системных факторов, что способствует валидации мишени в доклинических моделях. Выделение релевантного заболеванию внеклеточного матрикса облегчает фенотипический скрининг и уточнение сигнальных путей для поиска антифибротических препаратов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Исследование терапевтической гипотезы о том, что ингибирование IRF5 снижает провоспалительный сигналинг и отложение внеклеточного матрикса у мышей с моделью плотной кожи (tight-skin mice).
- Практическая ценность: Обеспечивает функциональную валидацию мишени посредством измерения ядерной транслокации IRF5 и последующей экспрессии ICAM в кардиомиоцитах.
- Прогностическая ценность: Помогает в приоритизации портфеля препаратов, демонстрируя улучшение эндотелиальной вазодилатации в качестве функционального биомаркера взаимодействия с мишенью.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Изолированный внеклеточный матрикс сердца представляет собой стандартизированную, релевантную заболеванию систему для оценки влияния соединений на поведение и сигнализацию клеток.
- Количественные показатели: Измерения вазодилатации ex vivo с использованием кривых зависимости «доза-ответ» для ацетилхолина позволяют точно оценить функцию эндотелия в изолированных артериях facialis.
- Повторное использование платформы: Протокол изоляции внеклеточного матрикса может быть перенесен на сосудистые русла задних конечностей, легких или других органов для поддержки кросс-органной валидации мишеней.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для заболевания: Используется модель мышей с тугоподвижной кожей, у которых наблюдается фиброз и сосудистая дисфункция, аналогичные склеродермии у людей.
- Трансляционная преемственность: Связывает ингибирование IRF5 с уменьшением изменений внеклеточного матрикса и улучшением вазодилатации, что способствует механистическому снижению рисков для клинического внедрения.
- Полезность доклинической модели: Позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении, демонстрируя таргетное улучшение сосудистой функции после хронического подкожного введения.
Интеграция в конвейеры и рабочие процессы
Данный метод интегрируется в процесс разработки — от валидации мишени до оценки доклинической эффективности, что позволяет осуществлять итерационный дизайн соединений, модулирующих IRF5, на основе сосудистых и матриксных фенотипов.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез путем выделения внеклеточного матрикса для изучения сигнальных путей «снаружи-внутрь», которые вызывают активацию IRF5 и провоспалительные реакции.
- Скрининг: позволяет получать готовые к анализу сосудистые ткани с воспроизводимыми ответами вазодилатации для оценки эффективности и селективности соединений.
- Аналитика: обеспечивает количественное измерение зависимых переменных (изменение диаметра сосудов) и получение статистических данных (EC50, % вазодилатации) для сравнения эффектов воздействия в разных группах.
- Трансляционные исследования: связывает взаимодействие с молекулярной мишенью (снижение уровня IRF5 в ядрах) с результатами на уровне тканей (ремоделирование ECM) и функциональным улучшением (вазодилатация) в системе, соответствующей патологии заболевания.
- Корпоративное повторное использование: создает воспроизводимую методику для изучения взаимодействий между внеклеточным матриксом и сосудами в различных системах органов и моделях заболеваний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность за счет отделения сосудистой функции от системных переменных, что повышает уверенность в установлении взаимосвязи между мишенью и заболеванием.
- Операционная ценность: Стандартизирует процедуры вазодилатации и выделения внеклеточного матрикса (ВКМ), повышая воспроизводимость результатов в разных лабораториях и способствуя кросс-функциональному сотрудничеству.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), связывая ингибирование мишени с функциональными исходами в сосудах, что снижает биологические риски на поздних этапах программ по изучению фиброза.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию терапии, направленной на IRF5, с учетом рисков, на основании подтвержденного улучшения функции эндотелия и гомеостаза матрикса.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области микрососудистой диссекции, манометрии (pressure myography) и биохимии внеклеточного матрикса.
- Необходимы специализированные инструменты, включая системы видеокалибровки, инвертированные микроскопы и резервуары давления для исследований вазодилатации.
- Требуется стандартизация процессов обработки тканей, состава буфера (MOPS) и протоколов сокращения (предварительное сужение с помощью U46619) для обеспечения сопоставимости данных.
- При применении метода изоляции внеклеточного матрикса к несердечным тканям необходимо учитывать особенности адаптации, включая оптимизацию реагентов для децеллюляризации (SDS, Triton X-100) и времени их воздействия.
- Практическое ограничение: хрупкость изолированного эндотелия требует тщательного соблюдения техники, чтобы избежать механических повреждений при канюляции и создании давления в сосуде.
