Нейроны обработки изображений внутри толстых срезов мозга с помощью метода Гольджи-Кокса

Общая цель данной процедуры заключается в определении эффективности воздействия на морфологию нейронов в головном мозге грызунов. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области нейронаук, такие как изучение нормальной и экспериментально измененной морфологии нейронов в различных областях мозга грызунов. Основным преимуществом данной методики является повышение вероятности идентификации и визуализации меченых нейронов, которые полностью расположены в пределах одного гистологического образца.

Начните окрашивание по методу Гольджи-Кокса, поместив свежий мозг мыши в стеклянный сцинтилляционный флакон объемом 20 мл, содержащий 17 мл раствора Гольджи-Кокса. Защитите от света и инкубируйте при комнатной температуре в течение 25 дней. По истечении периода инкубации проведите криопротекцию мозга, поместив его в 40 мл сахарозного криопротектора, и инкубируйте в темноте при 4 °C в течение 24 часов.

После инкубации в сахарозе мозг можно заморозить для длительного хранения или сразу приступить к блокировке для последующего секционирования, как показано в следующем разделе видео. При замораживании полностью погрузите мозг в 200 milliliters изопентана, предварительно охлажденного на сухом льду. Затем поместите замороженный мозг в коническую пробирку объемом 50 milliliter и храните в темноте при температуре minus 80 degrees celsius.

Для начала извлеките мозг из раствора сахарозы. С помощью лезвия заблокируйте его для последующего секционирования, отрезав мозжечок, чтобы на оставшемся каудальном конце мозга образовался плоский край. Блокировку мозга необходимо выполнять под строго определенным углом, чтобы интересующие нейроны полностью попадали в полученные срезы.

Например, для пирамидных нейронов коры головного мозга мы используем корональную плоскость, расположенную строго перпендикулярно рострально-каудальной оси. Затем нагрейте агар до расплавления и дайте ему остыть до температуры, чуть превышающей точку плавления.

Затем поместите мозг в небольшую одноразовую чашку для взвешивания каудальным концом вниз. Добавьте расплавленный агар, чтобы полностью покрыть мозг. После затвердевания агара удалите излишки, оставив примерно два-четыре миллилитра вокруг мозга.

Затем с помощью небольшого количества этилцианоакрилата приклейте мозг к предметному столику вибратома каудальным концом вниз. Заполните область столика вибратома достаточным количеством криопротектора на основе сахарозы, чтобы полностью покрыть мозг. После этого выполните секционирование мозга с толщиной среза от 400 до 500 мкм, в зависимости от исследуемой области мозга.

С помощью маленькой кисточки поместите срезы мозга в лунки шестилуночного планшета для культивирования тканей с вставками с сетчатым дном, предварительно заполненные сукрозно-фосфатным буфером. Во время изготовления срезов защищайте образцы от света. По завершении секционирования инкубируйте срезы в темноте при температуре 4 °C в течение ночи.

С помощью вставок с сетчатым дном перенесите срезы мозга в новую лунку, содержащую 5 mL параформальдегида в фосфатном буфере. Инкубируйте на шейкере (рокере) при медленной скорости при комнатной температуре в темноте в течение 15 минут. Промойте срезы дважды, перенося их в новые лунки, содержащие 5 mL воды.

Защитите от света и промывайте на умеренной скорости при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем перенесите срезы в новую лунку, содержащую пять миллилитров гидроксида аммония. Медленно перемешивайте на качалке в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут.

Промойте срезы дважды, перенося их в новые лунки, содержащие пять миллилитров воды. Промывку следует проводить на шейкере (качалке) при умеренной скорости в темноте при комнатной температуре в течение пяти минут. Перенесите срезы в новую лунку, содержащую пять миллилитров разведенного фиксатора А. Инкубируйте на шейкере при низкой скорости в темноте при комнатной температуре в течение 25 минут.

Промойте срезы в воде дважды, как и в предыдущем случае. С помощью небольшой кисти перенесите срезы на предметное стекло, затем с помощью пинцета и небольшой салфетки удалите излишки воды и агара. Перед переходом к этапам дегидратации убедитесь, что весь агар полностью удален.

Оставьте срезы высыхать на воздухе при комнатной температуре в защищенном от света месте. Правильное время высушивания имеет решающее значение и должно быть определено для каждой конкретной лаборатории. Слишком короткое время высушивания может привести к отслоению срезов от предметных стекол во время этапов дегидратации, а слишком длительное — к растрескиванию срезов.

После высушивания сначала поместите стекла в просветляющий агент на пять минут. Поместите стекла в 100% ethanol на пять минут. Затем последовательно перенесите их в серию растворов ethanol с убывающей концентрацией, выдерживая в каждом по две минуты.

После серии спиртов выдержите стекла в воде в течение пяти минут. Затем окрасьте их 0,5% раствором крезилового фиолетового в воде в течение семи минут. После окрашивания крезиловым фиолетовым выдержите стекла в воде в течение двух минут.

Затем обезвоживают срезы, пропуская их через серию спиртовых растворов возрастающей концентрации по две минуты в каждом. Затем проводят две промывки в 100% ethanol по пять минут. Помещают в просветляющий агент на пять минут.

Наконец, добавьте безводную среду для заключения и накройте срезы покровным стеклом. Оставьте предметные стекла сохнуть в горизонтальном положении в темноте при комнатной температуре не менее пяти дней. Для получения стеков изображений высокого разрешения области, содержащей интересующий нейрон, сначала выберите на микроскопе иммерсионный объектив с силиконовым маслом 30X 1.05 NA.

Затем нанесите на предметное стекло три-четыре капли иммерсионного силиконового масла. Установите объектив над стеклом, обеспечив контакт объектива с маслом. Сфокусируйте изображение и настройте параметры камеры, включая экспозицию и баланс белого, в программном обеспечении для визуализации.

Затем установите верхнюю и нижнюю границы стека изображений: сфокусируйтесь на верхней части среза, а затем выберите «set» рядом с «top of stack» в окне сбора изображений. После этого сфокусируйтесь на нижней части среза и выберите «set» рядом с «bottom of stack». Установите шаг сканирования, введя значение 1 µm рядом с «distance between images» в окне сбора изображений.

Наконец, сделайте серию снимков (стек), выбрав команду acquire image stack в окне сбора изображений. Повторите предыдущие шаги для захвата всей интересующей области, следя за тем, чтобы все стеки изображений перекрывали друг друга минимум на 10% по осям X и Y. Данное изображение коры головного мозга представляет собой объединенную Z-проекцию стеков изображений, полученных от среза толщиной 500 micron с использованием объектива 10X.

Ткань на данном изображении была обработана с использованием основного протокола для свежих образцов. Область, отмеченная красным квадратом, была сфотографирована с помощью 30-кратного иммерсионного объектива с силиконовым маслом, и был получен стек изображений с объединенной Z-проекцией высокого разрешения. Красная стрелка указывает на двумерную Z-проекцию нейрона, трассировку которого провели на основе стека изображений высокого разрешения с 30-кратным увеличением.

Здесь был использован новый вариант протокола с окрашиванием крезиловым фиолетовым. На данном изображении с более высоким разрешением показан срез, окрашенный крезиловым фиолетовым. А здесь представлен полученный трейсинг нейрона.

Наконец, данная ткань была обработана с использованием варианта протокола, при котором мозг замораживают после импрегнации по методу Гольджи-Кокса. Здесь предварительно замороженная ткань представлена с более высоким разрешением. И снова получена высококачественная двумерная Z-проекция трассировки нейрона.

Данную методику можно выполнить в течение одного месяца, при этом этапы обработки и визуализации завершаются на последней неделе. В качестве альтернативы мозг можно заморозить после импрегнации по методу Гольджи-Кокса, что позволит провести обработку и визуализацию в более поздние сроки. После выполнения этой процедуры нейробиологи могут использовать полученные изображения для проведения детального морфологического анализа, например, определения сложности дендритов или плотности шипиков, чтобы установить, как экспериментальное воздействие может изменить структуру нейронов головного мозга.