Нейроны обработки изображений внутри толстых срезов мозга с помощью метода Гольджи-Кокса

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы определить эффективное лечение морфологии нейронов в мозге грызунов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, такие как нормальная и экспериментально манипулируемая морфология нейронов в различных областях мозга грызунов. Основное преимущество данной методики заключается в повышении вероятности идентификации и визуализации меченых нейронов, которые полностью содержатся в пределах отдельных гистологических образцов.

Начните окрашивание по методу Гольджи-Кокса, поместив свежий мозг мыши в стеклянный сцинтилляционный флакон объемом 20 миллилитров, содержащий 17 миллилитров раствора Гольджи-Кокса. Беречь от света и выдерживать при комнатной температуре в течение 25 дней. По истечении инкубационного периода крио защищает мозг, помещая его в 40 миллилитров сахарозного криопротектора, и инкубирует в темноте при температуре 4 градуса Цельсия в течение 24 часов.

После инкубации в сахарозе мозг может быть заморожен для длительного хранения или немедленно заблокирован для разделения, как показано в следующем разделе видео. При замораживании погрузите весь мозг в 200 миллилитров изопентана, который был предварительно охлажден на сухом льду. Затем поместите замороженный мозг в коническую пробирку объемом 50 миллилитров и храните в темноте при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Для начала удалите мозг из сахарозы. И используйте лезвие бритвы, чтобы заблокировать его для рассечения, отрезав мозжечок, оставив плоский край на оставшемся каудальном конце мозга. Мозг должен быть заблокирован под точным углом, чтобы гарантировать, что интересующие нейроны полностью содержатся в полученных участках.

Например, мы используем корональную плоскость, которая идеально перпендикулярна ростральной каудальной оси для пирамидальных нейронов коры головного мозга. Далее нагреваем агар до его расплавления. И дайте ему остыть, пока он не станет немного выше точки плавления.

Затем поместите мозг в небольшую одноразовую чашку для взвешивания каудальным концом вниз. Добавьте расплавленный агар, чтобы покрыть мозг. Как только агар затвердеет, обрежьте излишки, оставив примерно два-четыре миллилитра вокруг мозга.

Затем используйте небольшое количество этилцианоакрилата, чтобы приклеить мозг к стадии вибратома каудальным концом вниз. Заполните область вибратома сахарозой в достаточном количестве криопротектора, чтобы покрыть мозг. Затем разрежьте мозг на толщину среза от 400 до 500 микрон в зависимости от исследуемой области мозга.

С помощью небольшой кисти поместите срезы мозга в лунки шестилуночного планшета для культуры тканей, содержащего сетчатые донные вставки и предварительно заполненного буфером фосфата сахарозы М. Беречь от света во время разделки. Когда закончите секционирование, инкубируйте секции в темноте при температуре четыре градуса Цельсия на ночь.

С помощью сетчатых нижних вставок перенесите участки мозга в новую лунку, содержащую пять миллилитров параформальдегида в фосфатном буфере. Инкубируйте на коромысле, движущемся с медленной скоростью при комнатной температуре в темноте в течение 15 минут. Дважды промойте срезы, перенеся их в новые лунки, содержащие пять миллилитров воды.

Беречь от света и стирать на умеренной скорости при комнатной температуре в течение пяти минут. Далее переложите срезы в новую лунку, содержащую пять миллилитров гидроксида аммония. Медленно покачивайте в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут.

Дважды промойте срезы, перенеся их в новые лунки, содержащие пять миллилитров воды. Стирайте на коромысле, двигаясь с умеренной скоростью в темноте при комнатной температуре в течение пяти минут. Переложите срезы в новую лунку, содержащую пять миллилитров разведенного фиксатора А. Инкубируйте на коромысле, движущемся с медленной скоростью в темноте при комнатной температуре в течение 25 минут.

Промойте секции в воде дважды, чем раньше. С помощью небольшой кисти поместите срезы на предметное стекло микроскопа, затем с помощью пинцета и небольшой салфетки удалите лишнюю воду и агар. Убедитесь, что весь агар удален, прежде чем приступать к этапам обезвоживания.

Дайте секциям высохнуть на воздухе при комнатной температуре в защищенном от света месте. Надлежащее время сушки имеет решающее значение и должно быть определено для каждой лаборатории. Слишком короткое время может привести к тому, что секции отвалятся от предметных стекол во время этапов обезвоживания, а слишком долгое время может привести к растрескиванию секций.

После высыхания сначала поместите предметные стекла в очищающее средство на пять минут. Поместите предметные стекла в 100% этанол на пять минут. Затем пройдите через серию убывающих концентраций этанола в течение двух минут каждая.

После спиртового ряда поместите горки в воду на пять минут. Затем окрасить в 0,5%-ный крезил фиалку в воде на семь минут. После окрашивания кресиловой фиалкой поместите предметные стекла в воду на две минуты.

Затем обезвоживайте срезы с помощью ряда повышающих концентраций алкоголя в течение двух минут каждый. Затем две стирки в 100% этаноле в течение пяти минут. Поместите в клиринговый агент на пять минут.

Наконец, добавьте безводный монтажный материал и наденьте на секции защитное стекло. Дайте предметным стеклам высохнуть в горизонтальном положении в темноте при комнатной температуре не менее пяти дней. Чтобы получить стеки изображений с высоким разрешением области, содержащей интересующий нейрон, сначала выберите на микроскопе объектив для погружения силиконового масла 30X 1.05 NA.

Затем нанесите на предметное стекло три-четыре капли силиконового иммерсионного масла. Поместите объектив на предметное стекло, обеспечивая контакт между объективом и маслом. Сфокусируйте изображение и отрегулируйте параметры камеры, включая экспозицию и баланс белого, в программном обеспечении для обработки изображений.

Затем установите верхнюю и нижнюю границы для стека изображений, сфокусировавшись на верхней части раздела, а затем выберите «Установить» рядом с верхней частью стопки в окне получения изображения. Затем сфокусируйтесь на нижней части раздела и выберите «Установить» рядом с нижней частью стопки. Установите расстояние шага равным одному микрону, введя один микрон рядом с расстоянием между изображениями в окне получения изображений.

Наконец, захватите стек изображений, выбрав «Получить стек изображений» в окне получения изображения. Повторите предыдущие шаги, чтобы захватить всю интересующую область, убедившись, что все стеки изображений перекрываются не менее чем на 10% по осям X и Y. Это изображение коры головного мозга представляет собой объединенную Z-проекцию стеков изображений, полученных из участка толщиной 500 микрон с использованием объектива 10X.

Ткань на этом снимке была обработана по основному протоколу all fresh. Область, обозначенная красным квадратом, была получена с помощью 30-кратного объектива для погружения в кремниевое масло, и был получен стек объединенных Z-проекционных изображений с более высоким разрешением. Красная стрелка показывает двумерную Z-проекцию нейрона, которая была отслежена из стека изображений с высоким разрешением 30X.

Здесь был использован свежий вариант протокола с окрашиванием в фиолетовый цвет. На этом изображении с более высоким разрешением показан участок, окрашенный в фиолетовый цвет. А это и есть полученная трассировка нейронов.

Наконец, эта ткань была обработана с использованием варианта протокола, при котором мозг замораживается после оплодотворения Гольджи-Кокса. Здесь ранее замороженная ткань видна с более высоким разрешением. И в очередной раз получена высококачественная двумерная Z-проекция трассировки нейронов.

Этот метод может быть завершен в течение одного месяца, а этапы обработки и визуализации будут завершены в течение последней недели. В качестве альтернативы мозг может быть заморожен после пропитки Гольджи-Кокса, что позволяет завершить обработку и визуализацию позже. Следуя этой процедуре, нейробиологи могут использовать полученные изображения для проведения детального морфологического анализа, такого как сложность дендрита или плотность шипа, чтобы определить, как экспериментальная манипуляция может изменить структуру нейронов в мозге.