Прямолинейный метод глюкозинолатов экстракции и анализа с высоким давлением жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)
15 марта 2017 г.
Здесь мы очень подробно описываем установленный и надежный протокол экстракции глюкозинолатов из измельченного растительного сырья. После обработки экстрактов сульфатазой на колонке десульфоглюкозинолаты элюируют и анализируют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления.
Общая цель данного протокола заключается в проведении простого и доступного анализа глюкозинолатов в растениях и других биологических образцах. Этот метод экстракции и анализа глюкозинолатов может быть использован для поиска ответов на ключевые вопросы в области экологии растений и насекомых, патологии растений, селекции и пищевых наук. Основным преимуществом данного метода является то, что он прошел тщательную валидацию и применим к широкому спектру биологических образцов.
Хотя этот метод в основном используется для количественного определения глюкозинолатов в растительных материалах, он также может быть применен к почвам или готовым пищевым продуктам. Данную процедуру экстракции можно провести практически в любой лаборатории, так как в основном используется стандартное лабораторное оборудование. Как правило, лицам, которые ранее не использовали данный метод, будет проще провести анализ и контроль, если они хотя бы один раз прочитают инструкцию и посмотрят видео.
Для начала процедуры смешайте 10 грамм сшитого декстринового геля G-25 с 125 миллилитрами ультрачистой воды. Храните смесь в закрытом флаконе при температуре 4 °C. Затем растворите 10 000 единиц арилсульфатазы типа H-1 в 30 миллилитрах ультрачистой воды.
Добавьте к этому 30 milliliters абсолютного этанола и тщательно перемешайте смесь. Центрифугируйте смесь при 2, 650 times G в течение 20 минут при комнатной температуре. Соедините супернатант с 90 milliliters абсолютного этанола в стакане.
Перемешайте и перенесите в новые центрифужные пробирки. Центрифугируйте смесь при 1 030 ×g в течение 15 минут при комнатной температуре. Удалите супернатант.
Растворите и объедините осадки в общем объеме 25 milliliters ультрачистой воды. Тщательно перемешайте смесь на вортексе, затем перенесите ее в пробирки объемом 1 milliliter. Храните образцы сульфатов при температуре 20 degrees Celsius в течение одного года.
Затем взвесьте около 90 миллиграммов синограмма и зафиксируйте массу с точностью до 1 микрограмма. После этого растворите моногидрат синограмма в 10 миллилитрах ультрачистой воды. Из полученного стокового раствора синограмма приготовьте пять рабочих растворов с концентрациями от 50 до 750 микромоляр.
Храните стандартные растворы в пробирках объемом 1.5 мл при температуре 20 °C. Затем для каждого образца и стандарта промаркируйте микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл в соответствующей позиции штатива. Проколите крышку каждой микроцентрифужной пробирки препаровальной иглой для последующей лиофилизации.
Поместите промаркированные пробирки в блок в той же конфигурации и с тем же интервалом, что и промаркированные колонки. Для подготовки стеклянных пипеточных колонок с помощью деревянного или стеклянного стержня осторожно вставьте в пипетку кусочек стеклянной ваты размером 1 сантиметр на 1 сантиметр. Утрамбуйте стеклянную вату в месте перехода корпуса пипетки в стержень.
Поместите одну пипеточную колонку в каждую промаркированную позицию на штативе. Расположите штатив над поддоном для отходов. Отрежьте конец пластикового наконечника для пипетки объемом 1 milliliter.
Тщательно встряхните приготовленный декстриновый гель. Затем с помощью расширенного наконечника дозатора внесите по 0,5 milliliters приготовленного декстринового геля в каждую колонку. Проверьте колонки на наличие утечек декстринового геля и замените все протекающие колонки.
После заполнения всех колонок декстриновым гелем промойте каждую колонку 1 миллилитром ультрачистой воды. Взвесьте от 50 до 100 миллиграммов предварительно измельченного растительного материала в реакционной пробирке объемом 2 миллилитра с защитной крышкой и запишите массу с точностью до 0,1 миллиграмма. Поместите в каждую пробирку по две металлические сферы диаметром 3 миллиметра.
Добавьте в каждую пробирку 1 миллилитр 70% methanol в ультрачистой воде и коротко перемешайте каждую смесь на вортексе. Закройте пробирки дополнительными защитными колпачками и немедленно поместите их в водяную баню с температурой от 90 до 92 градусов Celsius. Нагревайте пробирки до тех пор, пока содержимое не начнет кипеть.
Перенесите пробирки в ультразвуковую баню и подвергните образцы ультразвуковой обработке с нагревом в течение 15 минут. Во время соникации начните размораживание сульфатного образца и синограмм-контролей. После соникации центрифугируйте образцы при 2,700 ×g в течение 10 минут при комнатной температуре.
Перенесите супернатанты и размороженные референсные синограммы в соответствующие колонки, стараясь не затягивать растительный материал в пипетку. Добавьте по 1 миллилиتر 70% метанола в каждую пробирку. Перемешайте смеси на вортексе.
Обработайте смеси ультразвуком с нагревом в течение 15 минут. Снова центрифугируйте пробирки в тех же условиях, что и прежде. Нанесите супернатанты на соответствующие колонки.
Добавьте в каждую колонку две порции 70% метанола по 1 milliliter, давая колонкам полностью высохнуть после каждой порции. Промойте каждую колонку 1 milliliter ультрачистой воды для удаления остатков метанола. Затем промойте каждую колонку двумя порциями по 1 milliliter 20 millimolar натрий-ацетатного буфера с pH 5.5.
Как только последние порции ацетатного буфера натрия стекут в штатив для отходов, извлеките штатив из поддона для отходов и промокните ножки штатива салфеткой. Расположите штатив над блоком промаркированных микроцентрифужных пробирок так, чтобы наконечники колонок находились в соответствующих пробирках. Нанесите по 20 µL сульфатного раствора на каждую колонку, убедившись, что раствор достиг поверхности материала колонки.
Промойте раствор сульфатазы в материал колонки, добавив 50 µL ацетатного буфера натрия. Очень важно, чтобы сульфатаза была вымыта в колонку. Фермент должен находиться в колонке для взаимодействия с интактными глюкозинолатами, связанными с материалом колонки.
После того как раствор сульфата будет промыт через каждую колонку, накройте колонки алюминиевой фольгой. Оставьте колонки на ночь. Затем элюируйте десульфоглюкозинолаты из каждой колонки двумя порциями ультрачистой воды по 0,75 мл.
Когда колонки полностью осушатся, извлеките штатив с колонками и закройте каждую пробирку крышкой. Заморозьте пробирки в жидком азоте или при температуре -80 °C в течение как минимум 30 минут. Лиофилизируйте образцы в течение 12–24 часов.
Растворите каждый остаток в 1 milliliter ультрачистой воды. Затем перенесите каждый образец и стандарт в маркированные виалы для ВЭЖХ. Проведите разделение экстрактов на обращенно-фазовой колонке CAT.
Используйте длину волны детектирования 229 нанометров. После разделения методом ВЭЖХ глюкозинолаты можно идентифицировать путем сравнения времени удерживания и УФ-спектров со стандартами известных глюкозинолатов. Концентрации глюкозинолатов в образце рассчитывают по калибровочной кривой синограммы и литературным значениям коэффициентов отклика.
На основании этого можно определить концентрации глюкозинолатов в исходном образце растения. При используемых условиях ВЭЖХ вредный прогоитрин элюируется достаточно рано и отделяется от биологически полезного глюкорафанина. Эндо-глюкозинолаты также хорошо разделяются.
Лиотропные ряды наблюдаются при увеличении количества связей в боковых цепях алконола, метилфол-алконола и метил-сольфинол-глюкозинолатов с более длинными цепями. Таким образом, неизвестные глюкозинолаты могут быть предварительно классифицированы на основе этих лиотропных рядов в сочетании с УФ-спектрами. При надлежащей подготовке один человек может экстрагировать от 150 до 200 образцов за один рабочий день.
Потребуется еще один день, чтобы нанести образцы на колонки, лиофилизировать их и подготовить к ВЭЖХ. После выполнения этой процедуры можно применить другие методы, такие как ЖХ-МС, для идентификации неизвестных десульфо-глюкозинолатов в вашей хроматограмме. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как экстрагировать глюкозинолаты из ваших биологических образцов и анализировать их с помощью ВЭЖХ.
Не забывайте, что работа с метанолом может быть чрезвычайно опасной, поэтому ее следует всегда проводить в вытяжном шкафу.
Обзор
В данной статье представлен подробный протокол экстракции глюкозинолатов из растительных материалов с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии. Данный метод разработан так, чтобы быть простым и применимым к различным биологическим образцам.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Экология растений и насекомых
- Фитопатология
- Пищевые науки
Теоретические основы
- Глюкозинолаты являются важными соединениями в растениях.
- Они играют роль в механизмах защиты растений.
- Понимание их концентрации может помочь в различных биологических исследованиях.
- Данный протокол валидирован для широкого спектра образцов.
Цель исследования
- Предложить надежный метод экстракции и анализа глюкозинолатов.
- Оказать содействие исследованиям в областях, связанных с изучением растений.
- Обеспечить возможность количественного определения глюкозинолатов в различных образцах.
Используемые методы
- Приготовление декстринового геля и раствора сульфатазы.
- Экстракция образцов с использованием метанола и соникации.
- Высокоэффективная жидкостная хроматография для проведения анализа.
- Сравнение времени удерживания и УФ-спектров со стандартами.
Основные результаты
- Успешное извлечение глюкозинолатов из растительных материалов.
- Валидация метода на различных биологических образцах.
- Идентификация глюкозинолатов с помощью ВЭЖХ.
- Потенциальные области применения в экологии и пищевых науках.
Выводы
- Данный протокол эффективен для анализа глюкозинолатов.
- Он может быть использован в различных условиях исследований.
- Дальнейшие исследования могут расширить области его применения в растениеводстве.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Точное количественное определение глюкозинолатов способствует валидации мишеней при поиске биоактивных соединений растительного происхождения, позволяя снизить механистические риски при разработке кандидатов для нутрицевтиков и средств защиты сельскохозяйственных культур. Данный метод обеспечивает прогностическую уверенность при разграничении благоприятных и неблагоприятных профилей глюкозинолатов, что помогает в идентификации ведущих соединений и приоритизации портфеля разработок в области сельскохозяйственной биотехнологии и создания функциональных продуктов питания. Его широкая применимость к различным тканям растений и биологическим образцам обеспечивает трансляционную преемственность на пути от этапа поиска до доклинической оценки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, связывая конкретные структуры глюкозинолатов с такими биологическими эффектами, как действие прогоитрина (вредное) или глюкорафанина (полезное).
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет надежного количественного определения неповрежденных глюкозинолатов после инактивации мирозиназы и обработки сульфатазой.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в прогнозах при валидации мишеней путем получения количественных данных для анализа зависимости «структура — активность».
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает подготовку валидированных биологических систем для последующих этапов анализа путем получения десульфоглюкозинолатов, пригодных для детектирования и количественного определения методом ВЭЖХ.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость анализа с помощью калибровочных кривых на основе синигрина и установленных коэффициентов отклика.
- Масштабируемость: позволяет обрабатывать 150–200 образцов на одного человека в день, что обеспечивает готовность к проведению высокопроизводительного скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: обеспечивает связь между профилированием глюкозинолатов на этапе первичных исследований и доклинической валидацией с использованием релевантных систем в патологии растений и пищевых науках.
- Прогресс с учетом рисков: поддерживает принятие решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) путем идентификации вредных продуктов распада (например, нитрилов) в противовес полезным (например, изотиоцианатам) на основе профилей глюкозинолатов.
- Согласованность биомаркеров: позволяет разрабатывать трансляционные биомаркеры путем корреляции концентраций глюкозинолатов с фенотипическими результатами в экологических исследованиях и селекции.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в общий процесс поиска и разработки: от ранней валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинических исследований, в частности, в рамках разработки нутрицевтиков и сельскохозяйственных культур с заданными признаками.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез и уточнению метаболических путей путем количественного определения профилей глюкозинолатов, которые определяют образование биоактивных продуктов распада.
- Скрининг: обеспечивает получение готовых к анализу количественных данных с помощью ВЭЖХ с PDA/УФ-детектированием, что позволяет проводить надежную оценку соединений в различных растительных матрицах.
- Аналитика: предоставляет измеряемые показатели (времена удерживания, УФ-спектры, расчеты концентрации), которые позволяют проводить сравнение условий и классификацию на основе структуры.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность доклинических исследований благодаря применению в области безопасности пищевых продуктов и здоровья растений, где продукты распада глюкозинолатов влияют на биологические результаты.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как многократно используемая аналитическая платформа благодаря зависимости от стандартного лабораторного оборудования и широкой совместимости образцов (растения, почва, пищевые продукты).
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение достоверности прогнозов при валидации мишеней, снижение механистической неопределенности при идентификации биоактивных соединений.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость в различных лабораториях с использованием доступного оборудования.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних стадиях разработки биоактивных соединений.
- Влияние на портфель: Приоритизация и принятие решений о дальнейшем продвижении проектов с учетом рисков на основе валидированного количественного определения глюкозинолатов.
Особенности реализации
- Требуется опыт в подготовке проб растений, ферментативной обработке и работе с ВЭЖХ.
- Зависит от наличия центрифуг, водяных бань, ультразвуковых бань, лиофилизаторов и систем ВЭЖХ с ПДА/УФ-детектором.
- Необходимо межкомандное согласование времени экстракции, инкубации с сульфатазой и подготовки калибровочного графика.
- Требуется учет особенностей адаптации для различных растительных матриц (листья, семена, корни) и образцов нерастительного происхождения (почва, пищевые продукты).
- Включает такие практические ограничения, как риски при работе с метанолом, требующие использования вытяжного шкафа, и этап лиофилизации продолжительностью 12–24 часа, влияющий на общее время выполнения анализа.
