Прямолинейный метод глюкозинолатов экстракции и анализа с высоким давлением жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

Общая цель этого протокола заключается в том, чтобы выполнить простой и понятный анализ глюкозинолатов в растениях и других биологических образцах. Этот метод извлечения и анализа глюкозинолатов может быть использован для ответа на ключевые вопросы экологии растений и насекомых, патологии растений, селекции растений и пищевых наук. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он хорошо проверен и широко применим к широкому спектру биологических образцов.

Хотя этот метод в основном используется для количественного определения глюкозинолатов в растительном сырье, его также можно применять в почве или готовых пищевых продуктах. Эту процедуру экстракции можно провести практически в любой лаборатории, потому что в основном используется стандартное лабораторное оборудование. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут проводить анализы и осмотр лучше, если они прочитают и посмотрят фильм хотя бы один раз.

Для начала процедуры смешайте 10 грамм геля сшитого декстрина G-25 со 125 миллилитрами сверхчистой воды. Храните смесь в закрытой бутылке при температуре 4 градуса Цельсия. Затем растворите 10 000 единиц арилсульфатазы типа H-1 в 30 миллилитрах сверхчистой воды.

Добавьте к этому 30 миллилитров абсолютного этанола и хорошо размешайте смесь. Центрифугируйте смесь при 2, 650 умноженных на G в течение 20 минут при комнатной температуре. Соедините надосадочную жидкость с 90 миллилитрами абсолютного этанола в стакане.

Перемешайте и залейте новые центрифужные пробирки. Центрифугируйте смесь при 1, 030 умножении G в течение 15 минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость.

Растворите и соедините гранулы в общей сложности 25 миллилитров сверхчистой воды. Хорошо переведите смесь в вихрь, а затем переложите смесь в пробирки объемом 1 миллилитров. Храните образцы сульфата при температуре 20 градусов Цельсия в течение одного года.

Далее взвесьте около 90 миллиграммов синограммы и запишите вес с точностью до 1 микрограмма. Затем растворите моногидрат синограммы в 10 миллилитрах сверхчистой воды. Приготовьте из этого синограммного стокового раствора пять эталонных растворов с концентрациями от 50 до 750 микромоляров.

Храните растворы сравнения в пробирках объемом 1,5 миллилитра при температуре 20 градусов Цельсия. Затем для каждого образца и образца пометьте микроцентрифужную пробирку объемом 2 миллилитра в положении штатива для колонны. Проткните крышку каждой микроцентрифужной пробирки иглой для последующей сублимационной сушки.

Поместите пробирки с маркировкой в блок в той же конфигурации и на том же расстоянии, что и колонки с маркировкой. Чтобы подготовить стеклянные колонки для пипетки, с помощью деревянного или стеклянного стержня аккуратно вдавите в пипетку кусок стекловаты размером 1 сантиметр на 1 сантиметр. Упакуйте стекловату в месте перехода от цилиндра пипетки к ножке.

Поместите колонку для пипеток в каждое отмеченное положение на штативе. Расположите решетку над лотком для мусора. Отрежьте конец пластикового наконечника для пипетки объемом 1 миллилитров.

Приготовленный гель декстрина хорошо взболтать. А затем с помощью расширенного наконечника пипетки загрузите в каждую колонку по 0,5 миллилитра приготовленного геля декстрина. Проверьте колонки на предмет утечки геля декстрина и замените все протекающие колонки.

После того, как все колонки были загружены гелем декстрина, промойте каждую колонку 1 миллилитром сверхчистой воды. Взвесьте от 50 до 100 миллиграммов свободного шага, тонко измельченного растительного материала в реакционной пробирке объемом 2 миллилитров с предохранительным колпачком и запишите вес с точностью до 0,1 миллиграмма. Поместите в каждую трубку по две металлические сферы диаметром 3 мм.

Добавьте в каждую трубку по 1 миллилитру 70%-ного метанола в сверхчистую воду, и кратковременно перемешайте каждую смесь. Закройте трубки дополнительными защитными колпачками и немедленно поместите их на водяную баню при температуре от 90 до 92 градусов Цельсия. Нагревайте трубки до тех пор, пока пила не начнет кипеть.

Перенесите пробирки в ультразвуковую ванну, и звуковым нагревом образцы в течение 15 минут. Во время ультразвуковой обработки начните размораживание образца сульфата и эталонов синограммы. После ультразвуковой обработки образцы центрифугируют при температуре 2,700 G в течение 10 минут при комнатной температуре.

Загрузите надосадочную жидкость и размороженные ссылки на синограмму в соответствующие столбцы, стараясь не втягивать растительные вещества в пипетку. Добавьте по 1 миллилитру 70%-ного метанола в каждую тюбик. Сделайте смеси вихревыми.

И ультразвуковым током нагревайте смеси в течение 15 минут. Снова центрифугируйте пробирки в тех же условиях, что и раньше. Загрузите надосадочную жидкость в соответствующие столбцы.

Добавьте две порции по 1 миллилитру 70% метанола в каждую колонку, позволяя колонкам высохнуть между каждой порцией. Остатки метанола смыть из каждой колонны 1 миллилитром сверхчистой воды. Затем промойте каждую колонку двумя порциями по 1 миллилитру 20 миллимолярного буфера ацетата натрия, pH 5,5.

После того, как последние порции буфера ацетата натрия стекнут в решетку для отходов, снимите решетку с лотка для отходов и вытрите ножки решетки салфеткой. Расположите штатив над блоком пробирок с маркировкой микроцентрифуг так, чтобы наконечники колонок находились в соответствующих пробирках. Загрузите по 20 микролитров раствора сульфата в каждую колонну, следя за тем, чтобы раствор достиг поверхности материала колонны.

Раствор сульфата смыть в материал колонны с 50 микролитрами буфера ацетата натрия. Очень важно, чтобы сульфат был смыт в колонну. Фермент должен находиться на колонке, чтобы реагировать на неповрежденные глюкозинолаты, связанные на колонке.

После того, как раствор сульфатата будет смыт на каждую колонну, накройте колонны алюминиевой фольгой. Дайте колоннам постоять на ночь. Затем добавьте десульфо-глюкозинолаты из каждой колонки двумя порциями сверхчистой воды по 0,75 миллилитра.

Как только колонки высохнут, снимите штатив для колонн и закройте крышкой каждую пробирку. Заморозьте пробирки в жидком азоте или при температуре 80 градусов Цельсия не менее чем на 30 минут. Сублимационная сушка образцов в течение 12–24 часов.

Растворите каждый остаток в 1 миллилитре сверхчистой воды. А затем перенести каждый образец и ссылку на промаркированные флаконы с образцами ВЭЖХ. Отделите экстракты в столбце CAT с обратной фазой.

Используйте длину волны обнаружения 229 нанометров. После разделения с помощью ВЭЖХ глюкозинолаты могут быть идентифицированы путем сравнения времени удержания и УФ-спектров с известными стандартами глюкозинолатов. Концентрации глюкозинолатов в образце рассчитываются на основе калибровочной кривой синограммы и литературных значений для факторов отклика.

Исходя из этого, можно определить концентрацию глюкозинолатов в исходном образце растения. В используемых условиях ВЭЖХ вредный прогоитрин проявляется довольно рано и отделяется от биологически полезного глюкорафанина. Эндоглюкозинолаты также хорошо отделяются.

Лиотропные ряды наблюдаются с увеличением звеньев боковой цепи для алконола, метилфол-алконола и более длинноцепочечных метил-сольфинол-глюкозинолатов. Таким образом, неизвестные глюкозинолаты могут быть предварительно классифицированы на основе этих лиотропных рядов в сочетании с УФ-спектрами. При правильной подготовке одним человеком за один рабочий день может быть извлечено от 150 до 200 образцов.

Потребуется еще один день, чтобы упомянуть о колонках, сублимационной сушке образцов и подготовке их для ВЭЖХ. После этой процедуры могут быть применены другие методы, такие как LCMS, для выявления неизвестных десульфо-глюкозинолатов на вашей хроматограмме. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как извлекать глюкозинолаты из ваших биологических образцов и анализировать их с помощью ВЭЖХ.

Не забывайте, что работа с метанолом может быть чрезвычайно опасной, и всегда должна проводиться под вытяжным шкафом.