Композитная поддержка микрогеля и внеклеточного матрикса для встроенной 3D-печати нейронных конструкций человека

Встроенная 3D-печать в композитах SHAPE преодолевает традиционные ограничения биофабрикации и позволяет точно рисовать механически чувствительные ткани внутри гидрогелей, которые напоминают естественную внеклеточную среду. Набор инструментов SHAPE основан на модульной конструкции биоматериала, что позволяет легко вносить изменения в рецептуру печатной подложки. Он также использует недорогие материалы и доступное оборудование для простой адаптации другими исследовательскими группами.

Этот подход может быть применен для создания пространственно определенных моделей нервной ткани человека для изучения развития нейронов и коммуникации при нейродегенеративных расстройствах, таких как болезнь Паркинсона. Начните с приготовления раствора карбоната кальция в сверхчистой воде в концентрации два миллиграмма на миллилитр. Смешайте его с раствором альгината в равном соотношении и магнитно перемешайте при 650 об/мин в течение одного часа при комнатной температуре.

Затем добавьте в эту смесь уксусную кислоту в соотношении один к 500 и снова перемешайте в течение ночи. На следующий день механически фрагментируйте желеобразный раствор альгината на микрочастицы при 15 000 об/мин в течение 10 минут с помощью гомогенизатора. Затем центрифугу для получения микрочастиц.

Осторожно выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте частицы в DMEM, содержащие два миллимоля гидроксида натрия и 1% пенициллина стрептомицина. Цвет подвески должен снова измениться на красный. Инкубируйте суспензию в течение ночи при четырех градусах Цельсия.

После инкубации суспензию гомогенизируют в течение трех минут при 15 000 об/мин и центрифугу при 18 500 г в течение 10 минут. После центрифугирования удалите надосадочную жидкость и понаблюдайте за гранулой на наличие плотно упакованных альгинатных микрочастиц. Чтобы получить композит SHAPE, смешайте гранулу альгинатных микрочастиц с разбавленным и нейтрализованным коллагеном в соотношении два к одному и нанесите его пипеткой вверх и вниз на лед.

Перелейте полученный композитный материал в охлаждаемую 24-луночную пластину. Перед печатью диссоциируйте ранее культивируемые нервные стволовые клетки человека или hNSC с помощью 0,025% раствора трипсина в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем нейтрализуют трипсин питательной средой и центрифугируют клеточную суспензию при 400 г в течение пяти минут при комнатной температуре.

После удаления надосадочной жидкости ресуспендируйте клеточную гранулу в двух-трех миллилитрах питательной среды. Используя тупую металлическую иглу 21 калибра, загрузите в шприц 100 микролитров плотно упакованных альгинатных микрочастиц. Затем загрузите подготовленную клеточную суспензию в шприц.

Для печати замените загрузочную иглу тупой металлической иглой 27-го калибра. Используя справочное программное обеспечение, после того, как структура для печати разработана, нажмите «Создать» для генерации G-кода. Вставьте шприц, загруженный в ячейку, в объемную экструзионную головку на экструзионном биопринтере и запишите длину иглы, нажав кнопку «Начать процесс измерения длины иглы».

Затем поместите пластину на 24 лунки, загруженную композитом SHAPE, на принтер и нажмите SHM, чтобы измерить высоту поверхности пустой скважины. Выберите pH 2, а затем символ гаечного ключа. Затем под установленным параметром измените объемный расход на 3.6 микролитра в секунду и нажмите «Применить параметр», а затем «Сохранить и готово».

Загрузите G-код в пользовательский интерфейс принтера, щелкнув значок открытия G-кода. Выберите значок программы запуска, чтобы начать процедуру печати. Сразу после печати инкубируйте гель SHAPE при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут для отжига.

Затем аккуратно добавьте питательную среду на отожженную гелевую подложку SHAPE. Для иммуноокрашивания удалите лишнюю среду из геля, и с помощью шпателя перенесите гель в емкость с DPBS. Как только пластина будет помещена в вытяжной шкаф, снимите DPBS.

Гель залить 4%-ным раствором формальдегида и выдерживать в течение часа при комнатной температуре. После умывания DPBS добавьте блокирующий раствор в гель. Аккуратно встряхните тарелку и выдерживайте в течение шести часов при комнатной температуре, чтобы предотвратить неспецифическое связывание.

Как только блокирующий раствор будет удален, добавьте первичное антитело в гель и осторожно встряхните его. Инкубируйте тарелку в течение 48 часов при четырех градусах Цельсия. После промывки DPBS аналогичным образом обработайте гель раствором вторичных антител в течение 24 часов.

Поместите окрашенный гель шпателем в лунку с тонким дном перед визуализацией. В настоящем исследовании чернила hNSC печатали нить клеток диаметром около 200 микрометров. Напечатанные нити были богаты жизнеспособными клетками с морфологией.

После 30 дней печати клетки проявили нейронную морфологию с мелкими клеточными телами и длинными тонкими отростками, что указывало на успешную дифференцировку hNSCs. Окрашивание тубулином бета три позволило визуализировать генерируемые нейронные сети с сохраненной геометрией. И в процессе дифференцировки клетки не мигрировали из напечатанных нитей.

Композит SHAPE можно использовать для производства перфузионных каналов путем печати жертвенными чернилами вместо ячеек. Кроме того, опора может включать в себя чувствительные к кислороду шарики для контроля напряжения кислорода в 3D-печатных конструкциях во времени и пространстве.