LERLIC-МС / МС для углубленной характеризации и Количественный глутамин и аспарагин Дезамидирование в Shotgun протеомике

Общая цель этой процедуры заключается в использовании протеомики дробовика для характеристики и количественного определения продуктов дезаминации эндогенного глутамина и аспарагина в сложных протеомах. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы биохимии, такие как влияние спонтанных и антиматических процессоров на изометрический продукт глутамина и дезаминирование аспарагиме. Основное преимущество этой методики заключается в том, что изомеры дезаминирования глутамина разделяются на длинной длине капиллярной колонке ионного изменения, что максимизирует способность разделять пептиды по изоматическим точкам.

Чтобы начать строительство колонны, суспензируйте в воде 50 миллиграммов слабого анионообменного упаковочного материала в 3,5 миллилитрах 90% изопропанола. Закрепите фитинг «мама-мама», микроферал и внутреннюю гайку на одном конце трубки длиной 50 сантиметров с внутренним диаметром 200 микрометров. Установите экран размером 1/16 дюйма с порами размером в один микрометр на конце трубки внутрь микрофералки.

Используя нагнетательный насос, установленный на 4 500 фунтов на квадратный дюйм, заполните анионный обмен в капилляр до тех пор, пока материал не станет виден наверху. Прикрепите еще один фитинг типа «мама-самка», микрофералу и женскую гайку к верхней части набивного капилляра на противоположном конце, чтобы завершить сборку колонны. Промойте от 50 до 100 миллиграммов ткани фосфатно-солевым буфером в течение пяти минут.

Повторите эту промывку дважды, а затем поместите вымытую салфетку в пробирки с безопасными колпачками. Добавьте в каждую пробирку по одному весовому эквиваленту бусин из нержавеющей стали и 2,5 эквивалента по объему водного 100 миллимолярного раствора ацетата аммония с 1% дезоксихолата натрия. Гомогенизируйте ткань с максимальной интенсивностью в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

Затем центрифугируйте гомогенат в течение десяти минут при температуре 10 000 x g и четырех градусах Цельсия. Переложите надосадочную жидкость в пробирку объемом 1,5 миллилитров. Продолжайте гомогенизацию и центрифугирование тканевой гранулы, каждый раз комбинируя надосадочную жидкость до тех пор, пока гранулы не исчезнут.

Количественно оцените концентрацию белка в комбинированных надосадочной жидкости с помощью анализа бицинхониновой кислоты. Затем добавьте к гомогенату одномолярный раствор дитиотреитола в 100 миллимолярном ацетате аммония, чтобы получить концентрацию дитиотреитола в 10 миллимолярах в образце. Выдержите гомогенат на водяной бане при температуре 60 градусов Цельсия в течение тридцати минут.

Добавьте к гомогенату одномолярный раствор йодоацетамида в 100 миллимолярном ацетате аммония для достижения концентрации йодоацетамида в образце 20 миллимоляров. Инкубируйте гомогенат при комнатной температуре при отсутствии света в течение 45 минут. Затем разбавьте гомогенат двумя объемными эквивалентами десятимиллимолярного раствора дитиотреитола в 100 миллимолярном ацетате аммония.

Инкубируйте гомогенат при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Добавьте к гомогенату достаточный объем модифицированного трипсина секвенирования в 100 миллимолярном ацетате аммония для достижения соотношения белковых ферментов 1 к 50 по весу в образце. Инкубируйте образец при температуре 30 градусов Цельсия в течение ночи, чтобы переварить гомогенат.

Угасить сбраживание 0,5% от массы образца муравьиной кислоты, выпав в осадок солей дезоксихолата натрия. Аккуратно перебейте образцы, содержащие соли SDC, а затем центрифугируйте образцы в течение десяти минут при температуре 12 000 x g и четырех градусах Цельсия. Сцедите надосадочную жидкость в новую пробирку, стараясь не потревожить гранулу солей SDC.

Повторно растворите соли в 0,5% по объему водном растворе гидроксида аммония, энергично перемешивая. Сконструируйте картридж с сорбентом C-18 весом один грамм с 5 миллилитрами ацетонитрила, а затем пятью миллилитрами 0,1% трифторуксусной кислоты в воде. Затем загрузите переваренный образец в картридж.

Промойте образцы от трех до пяти раз пятью миллилитровыми порциями 0,1% TFA. Затем разведите пептиды пятью миллилитрами водного раствора 75% ацетонитрила, и 0,1% муравьиной кислоты. Высушите жидкость в вакуумном концентраторе.

Добавьте 200 микролитров 75% ацетонитрила, с 0,1% муравьиной кислотой к остатку. Вортсируйте смесь в течение не менее десяти минут, а затем обрабатывайте смесь ультразвуком в течение не менее 30 минут, чтобы восстановить сухие пептиды. Разбавляйте образец по мере необходимости, чтобы введенный образец содержал от одного до трех микрограммов белка.

Подключите капиллярный столбик LAX к прибору для жидкостной хроматографии сверхвысокого давления. Приготовьте 0,1%-ные растворы муравьиной кислоты в воде и ацетонитриле. Установите скорость потока на 0,4 микролитра в минуту и настройте градиентный прогон продолжительностью 1 200 минут.

Настройте события сканирования масс-спектрометра для альтернативного сбора данных между масс-спектрометрией с полным преобразованием Фурье и тандемной масс-спектрометрией с преобразованием Фурье. Выполните LERLIC MS/MS для разделения и определения характеристик пептидов. Используйте полученные данные и протеомное программное обеспечение для выполнения поиска в базе данных белков.

Экспортируйте результаты поиска по базе данных в программное обеспечение для работы с электронными таблицами. Определите и извлеките список дезамидированных пептидов и соответствующих недезамидированных пептидов. Извлеките ионные хроматаграммы каждого из этих пептидов с допуском по массе пять частей на миллион.

Проверьте выделенные ионные хроматаграммы на предмет разделенной иллюзии двойного пика изомерных продуктов. С помощью LERLIC MS/MS дезамидированные изоформы глутамина и аспарагина были отделены и идентифицированы из образца белка в два разных времени удержания. Были идентифицированы ферментативно модифицированные промежуточные глутаминовые остатки трансаминации, показывающие обратное соотношение гамма-альфа-глутамил.

Промежуточный продукт сукцинимида в остатках аспарагина также был идентифицирован с помощью этого метода. Поскольку условия обработки образца слабокислые, стабилизируют промежуточный продукт сукцинимида. Это говорит о том, что метод LERLIC MS/MS может быть применен для протеомного исследования протеомных промежуточных продуктов сукцинимида.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биохимии к характеристике дезаминации белков в различных контекстах — от археологии до биомедицинских исследований.