Гидролиз Ni-Шифф-Base комплекс Использование Условия Пригодные для удержания кислотно-лабильных защитных групп
6 апреля 2017 г.
Здесь мы представляем эффективный гидролиз и последующую защиту Fmoc аминокислоты, выделенной из никель-Шифф-щелочного комплекса. Гидролиз условие, представленное здесь, является подходящим для использования, когда требуется сохранение кислотно-лабильной боковой цепь защитных групп. Эта техника может быть адаптированы к различным неестественных аминокислотных субстратов.
Общая цель данной процедуры заключается в удобном выделении ненатуральных аминокислот из комплекса никеля с основанием Шиффа и их последующем Fmoc-защите. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области органической химии, такие как способы облегчения синтеза ненатуральных аминокислот. Основным преимуществом данной методики является возможность выделения аминокислот с кислотолабильными защитными группами боковых цепей из комплекса никеля с основанием Шиффа.
Лица, впервые использующие данный метод, могут столкнуться с трудностями из-за ограниченной растворимости никелевого комплекса в органических растворителях. DMF является наиболее подходящим растворителем, так как он способен растворить комплекс и смешивается с водой. Идея данного метода возникла у нас после консультации с нашим профессором неорганической химии, доктором Boron, касательно никеля и металлхелатирующих агентов.
Для начала данной процедуры добавьте 40 мл DMF в круглодонную колбу объемом 250 мл. Растворите один ммоль комплекса никеля с основанием Шиффа PBB в DMF при перемешивании при комнатной температуре. Затем добавьте 60 мл 0,2 М водного раствора EDTA при pH 4,5.
Используя магнитный перемешиватель и магнитный якорь, перемешивайте раствор в течение ночи. По завершении реакции перенесите раствор в делительную воронку объемом 250 milliliter. Добавьте 50 milliliters DCM.
Затем закройте делительную воронку пробкой и перемешайте. Слейте органическую фазу промывки в стакан для отходов. Повторите процесс добавления DCM, перемешивания и удаления органической фазы промывки три раза.
После этого соберите оставшийся водный слой в круглодонную колбу объемом 250 milliliter. Сначала используйте твердый бикарбонат натрия, чтобы довести pH выделенного водного слоя до pH seven. Затем добавьте 168 milligrams бикарбоната натрия.
Перемешайте раствор с помощью магнитной мешалки и перемешивающего устройства. Критически важно довести pH до семи, добавив два эквивалента бикарбоната натрия. Это необходимо, так как раствор должен быть слабощелочным для обеспечения защиты Fmoc.
В виале объемом 10 миллилитров растворите 337 миллиграмм Fmoc и гидроксисукцинимидного эфира в пяти миллилитрах диоксана. Перенесите эту смесь в водный раствор и перемешивайте в течение ночи. На следующий день используйте 1 M гидрохлоридную кислоту для подкисления раствора до pH 2.
После этого перенесите реакционную смесь в делительную воронку объемом 250 мл. Добавьте 50 мл этилацетата. Важно, чтобы pH не опускался ниже 2 и чтобы данный этап был выполнен быстро.
Несоблюдение этого условия может привести к потере защитных групп боковых цепей. Закройте делительную воронку пробкой и тщательно перемешайте. Затем соберите органический слой в колбу Эрленмейера объемом 250 мл.
Повторите процесс добавления этилацетата, перемешивания и сбора органического слоя еще дважды, объединив органические экстракты. Затем высушите объединенные органические экстракты, используя примерно три грамма сульфата магния. С помощью роторного испарителя сконцентрируйте объединенные органические экстракты для получения сырой Fmoc-защищенной аминокислоты.
В данном исследовании остов аминокислоты выделяют из комплекса никеля с основанием Шиффа при умельных значениях pH, после чего проводят Fmoc-защиту в два критических этапа. На первом этапе перемешивают раствор ЭДТА в смеси ДМФ и воды для облегчения высвобождения аминокислоты из комплекса. После выделения и экстракции высвобожденная аминокислота подвергается воздействию условий Fmoc-защиты, в результате чего образуется Fmoc-защищенная аминокислота.
Ход реакции гидролиза отслеживают по изменению цвета раствора с красного на белый. Реакции с использованием менее восьми эквивалентов EDTA демонстрируют частичное изменение цвета, но всегда остаются незавершенными. В то время как в реакциях без EDTA изменение цвета не наблюдается вовсе.
Следовательно, для завершения реакции требуется не менее восьми эквивалентов EDTA. Затем оценивается влияние pH на реакцию гидролиза. Успешный гидролиз наблюдается при значениях pH в диапазоне от 4.5 до 7.5 при перемешивании в течение ночи при комнатной температуре.
Это демонстрирует гибкость гидролиза EDTA. Затем возможность применения этих условий гидролиза проверяется на ряде аминокислот с различными защитными группами боковых цепей. В каждом случае защитные группы боковых цепей полностью сохраняются, что подтверждается методом протонного ЯМР.
После освоения данной методики ее выполнение при правильном соблюдении всех этапов занимает 48 часов. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости строгого соблюдения указанного уровня pH на протяжении всего процесса. После выполнения данной процедуры можно применять другие методы, такие как гидролиз других аминокислот с кислотолабильными защитными группами боковых цепей, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о применимости данной техники для различных субстратов.
После разработки эта методика откроет исследователям в области органического синтеза путь к изучению синтеза неестественных аминокислот с кислотолабильными защитными группами боковых цепей. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изолировать аминокислоты из комплекса никеля с основанием Шиффа PPB, используя условия реакции с мягким диапазоном pH. Не забывайте, что работа с органическими растворителями, в частности с DMF, может быть крайне опасной, и при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование средств индивидуальной защиты.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен эффективный метод выделения ненатуральных аминокислот из комплекса никеля с основанием Шиффа с их последующей защитой Fmoc-группой. Протокол специально разработан для сохранения кислотолабильных защитных групп боковых цепей, что делает полученные аминокислоты пригодными для использования в твердофазном пептидном синтезе. Метод основан на использовании мягких условий гидролиза и может быть адаптирован для различных субстратов ненатуральных аминокислот.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Органическая химия
- Синтез пептидов
- Химия неестественных аминокислот
Теоретические основы
- Неприродные аминокислоты все чаще используются в синтетических пептидных последовательностях для исследовательских и терапевтических целей.
- Традиционные методы гидролиза для выделения этих аминокислот из комплексов на основе оснований Шиффа с никелем часто требуют сильнокислых условий.
- Кислотный гидролиз может привести к удалению кислотолабильных защитных групп боковых цепей, что ограничивает применимость полученных аминокислот в пептидном синтезе.
- Существует потребность в более мягких протоколах гидролиза, позволяющих сохранить эти защитные группы.
Цель исследования
- Разработать удобный и эффективный метод выделения неестественных аминокислот из комплексов никеля с основаниями Шиффа.
- Обеспечить сохранение кислотолабильных защитных групп боковых цепей в процессе гидролиза.
- Продемонстрировать последующее Fmoc-защищение выделенных аминокислот в мягких условиях.
Используемые методы
- Растворение комплекса никеля с основанием Шиффа в ДМФА — растворителе, подходящем как для органической, так и для водной фаз.
- Гидролиз с использованием водного раствора ЭДТА при pH 4.5–7.5 с перемешиванием в течение ночи для высвобождения аминокислоты из комплекса.
- Экстракция и доведение pH до нейтрального (pH 7) с помощью бикарбоната натрия.
- Fmoc-защита путем добавления Fmoc-гидроксисукцинимидного эфира в диоксане с последующим перемешиванием в течение ночи.
- Подкисление до pH 2 и экстракция этилацетатом для выделения Fmoc-защищенной аминокислоты.
- Сушка и концентрирование органических экстрактов для получения конечного продукта.
Основные результаты
- Данный метод обеспечивает полный гидролиз никелевого комплекса при использовании не менее восьми эквивалентов ЭДТА.
- Гидролиз эффективно протекает в диапазоне pH от 4.5 до 7.5, что обеспечивает гибкость и мягкие условия реакции.
- Защитные группы боковых цепей полностью сохраняются, что подтверждено анализом ПМР (протонным ЯМР).
- Протокол применим к различным аминокислотным субстратам с разными защитными группами.
- После освоения метода вся процедура может быть выполнена примерно за 48 часов.
Выводы
- Данный метод позволяет проводить выделение и Fmoc-защиту ненатуральных аминокислот с кислотолабильными защитными группами в боковых цепях в мягких условиях.
- Метод эффективен, гибок и широко применим к различным аминокислотным субстратам.
- Он облегчает синтез ненатуральных аминокислот, подходящих для твердофазного пептидного синтеза, и способствует развитию исследований в области органической химии и химии пептидов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Сохранение кислотолабильных защитных групп при выделении аминокислот имеет решающее значение для обеспечения последующих этапов синтеза пептидов в фармацевтических исследованиях и разработках. Данный протокол гидролиза позволяет подготавливать неестественные аминокислоты, совместимые с твердофазным пептидным синтезом, что способствует быстрому созданию разнообразных структур-лидеров и изучению зависимости «структура — активность». Этот метод устраняет основное узкое место в синтезе сложных пептидных строительных блоков для программ на стадии поиска новых лекарственных соединений.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает синтез структурно разнообразных неестественных аминокислот для исследования биологических мишеней.
- Способствует снижению механистических рисков за счет возможности введения чувствительных функциональных групп в боковых цепях.
- Облегчает быструю генерацию вариантов пептидов для изучения взаимодействия с мишенью.
Скрининг и разработка методов анализа
- Обеспечивает наличие кислотолабильных защищенных аминокислот, подходящих для автоматизированных платформ твердофазного синтеза пептидов.
- Гарантирует воспроизводимость и стандартизацию библиотек пептидов за счет сохранения защитных групп.
- Позволяет масштабировать подготовку строительных блоков для кампаний высокопроизводительного скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Позволяет осуществлять синтез пептидов с модификациями, имеющими значение для патологии, для оценки в доклинических моделях.
- Обеспечивает непрерывность перехода от ранних этапов поиска к доклинической валидации за счет сохранения химической целостности пептидных кандидатов.
- Снижает риск неудач на поздних стадиях, обусловленных потерей критически важных функциональных групп боковых цепей.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол гидролиза и защиты находится на стыке химического синтеза и создания ведущих пептидных соединений, связывая этап первичного поиска с доклиническими исследованиями.
- Открывательная биология: позволяет проверять гипотезы с использованием специализированных аналогов аминокислот и зондов сигнальных путей.
- Скрининг: обеспечивает получение защищенных аминокислот, готовых для включения в библиотеки скрининга.
- Аналитика: обеспечивает количественное сохранение защитных групп, подтвержденное методом ЯМР, для надежного сравнения в различных условиях.
- Трансляционные исследования: сохраняет целостность боковых цепей для последующих биологических и фармакологических исследований.
- Корпоративное повторное использование: адаптируемый протокол поддерживает широкий спектр аминокислотных субстратов, повышая полезность платформы в различных программах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов в исследованиях структуры и функций пептидов, а также при валидации мишеней.
- Операционная ценность: Стандартизирует подготовку аминокислот, улучшая воспроизводимость и масштабируемость.
- Стратегическая ценность: Ускоряет принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет обеспечения быстрого синтеза различных кандидатных пептидов.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию с учетом рисков путем устранения узких мест синтеза при оптимизации ведущих соединений.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области органического синтеза и рабочих процессов пептидной химии.
- Необходим доступ к оборудованию, совместимому с DMF, и аналитическим инструментам, таким как ЯМР.
- Требуется строгий контроль pH и стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости результатов.
- Метод адаптируем для различных аминокислотных субстратов с разными защитными группами.
- Ограничен требованиями к растворимости и необходимостью осторожного обращения с опасными растворителями.
