Интеграция миниатюрной твердофазной экстракции и LC-MS / MS Обнаружение 3-нитротирозина в моче человека для клинических применений

Общая цель этой миниатюрной твердофазной экстракции в сочетании с анализом ЖХ-МС/МС заключается в точном количественном определении свободного 3-нитротирозина в человеческой моче для клинического применения. Свободный 3-нитротирозин помогает повысить урожайность и является биомаркером окислительного стресса. Тем не менее, точное количественное определение 3-нитротирозина в биологических чрезвычайных ситуациях для клинического применения будет оставаться особой проблемой из-за недостаточной чувствительности, селективности и громоздких образцовоготовок.

Этот метод, включающий эффективную твердофазную экстракцию в высокочувствительном взаимодействии ЖХ-МС/МС, позволяет быстро, специфично и точно определять низкие уровни эндогенного 3-нитротирозина в моче человека без необходимости построения конституции и двумерного ЖХ. Хотя этот метод может дать представление об исследовании окислительного стресса, он также может быть применен к другим патологическим состояниям, таким как сложные воспалительные и нейродегенеративные расстройства. Применение этого метода может быть расширено в сторону мониторинга эффективности антиоксидантного лечения, поскольку уровень 3-нитротирозина может быть снижен антиоксидантами. Чтобы начать эту процедуру, вортекс предварительно подготавливают и размораживают образцы мочи, стандарты и образцы контроля качества.

После вортекса добавьте по 250 микролитров каждого образца и стандарт в 32 лунки чистой двухмиллилитровой 96-луночной сборной тарелки. Добавьте по 50 микролитров предварительно приготовленного внутреннего стандартного рабочего раствора в каждую лунку, кроме двойной заготовки образца. Затем добавьте 50 микролитров воды класса LC-MS с 0,01% муравьиной кислоты в двойную пустую лунку для образца.

После этого добавьте в лунки 250 микролитров воды марки LC-MS с 0,1% муравьиной кислоты. Затем трижды перемешать растворы восьмиканальной пипеткой и накрыть пластину до загрузки SPE. Затем поместите микропланшет для экстракции 96 лунок с катионобменом в смешанном режиме и коллекторный резервуар на процессор с положительным давлением.

Твердофазная экстракция с использованием микропланшета со смешанным режимом катионного обмена позволяет одновременно очищать образец и обогащать 3-нитротирозин за одну экстракцию. Кондиционируйте экстракционную пластину, пропуская через сорбент 200 микролитров метанола марки LC-MS. Поверните ручку регулировки давления на процессоре положительного давления, чтобы установить низкое положительное давление, чтобы смесь медленно протекала через сорбент, регулируя давление при необходимости.

Уравновесить путем пропускания через сорбент 200 микролитров воды класса LC-MS с 2%-ной муравьиной кислотой. С помощью восьмиканальной пипетки осторожно загрузите весь объем каждого из предварительно смешанных образцов на предварительно подготовленную экстракционную пластину. Установите низкое положительное давление на процессоре положительного давления, чтобы смесь медленно протекала через сорбент, регулируя давление по мере необходимости.

После этого промыть скважины, пропустив через сорбент 200 микролитров воды марки ЛК-МС с 2%-ной муравьиной кислотой. После промывки 200 микролитрами метанола и водой, установите положительное давление процессора на высокое давление, чтобы просушить лунки. Как только лунки высохнут, замените резервуар чистой двухмиллилитровой 96-луночной сборной пластиной.

Теперь нанесите 50 микролитров 25 миллимолярного раствора ацетата аммония, чтобы медленно вымыть задержанный аналит и внутренний стандарт из экстракционной пластины. Затем добавьте 50 микролитров воды класса LC-MS с 5% муравьиной кислотой для нейтрализации элюента. Применение мягкого раствора ацетата аммония для элюирования 3-нитротирозина обеспечивает существенное повышение селективности и чувствительности.

Смешайте образцы с помощью восьмиканальной пипетки три раза при подготовке к жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии. После настройки прибора ЖХ-МС/МС уравновесьте метод 3-нитротирозина ЖХ-МС/МС в течение 10 минут с помощью градиентного элюирования ЖХ. При уравновешивании метода градиент LC будет уравновешен к исходному элюированию градиента.

Температура автоматического пробоотборника будет установлена на четыре градуса Цельсия, а температура духовки будет установлена на 30 градусов Цельсия. Создайте список партий, включающий образцы мочи, стандарты и образцы контроля качества. Затем начните замес с введения подготовленных образцов.

После завершения всех инъекций установите стандартную кривую с диапазоном от 10 до 2500 пикограмм на миллилитр для количественного определения 3-нитротирозина путем линейной регрессии отношения пиковой площади 3-нитротирозина и внутренней стандартной концентрации по отношению к номинальной концентрации 3-нитротирозина. Наконец, количественно оцените все остальные образцы с помощью установленной стандартной кривой и определите, попадают ли образцы контроля качества в установленный диапазон. Данные LC образцов мочи человека показывают, что 3-нитротирозин хроматографически отделен от других структурно сходных аналогов тирозина в оптимизированных условиях, что устраняет интерференцию соэлюирования, вызванную этими чрезвычайно избыточными соединениями, и, следовательно, повышает степень селективности анализа.

На хроматограмме для мониторинга множественных реакций двойного пустого образца сигнал 3-нитротирозина не наблюдается, что указывает на то, что 3-нитротирозин не образуется в течение всего процесса. Приведены репрезентативные хроматограммы мониторинга множественных реакций 3-нитротирозина и внутренний стандарт для здорового человека. Не наблюдалось интерферирующих сигналов во времена удержания 3-нитротирозина и внутреннего стандарта.

Здесь показана репрезентативная стандартная кривая. Предел обнаружения, определенный как самая низкая концентрация с отношением сигнал/шум более трех, был определен равным двум пикограммам на миллилитр. Нижний предел количественного определения был определен равным 10 пикограммам на миллилитр и определен как самая низкая концентрация в пределах 20% погрешности и точности с отношением сигнал/шум более 10.

Точно настроенный интеграционный анализ обеспечивает значительное повышение специфичности, чувствительности и производительности при снижении матричного эффекта, использования сорбента и утилизации отходов. С помощью этого простого и быстрого анализа образец мочи может быть обработан в течение 24 часов. Примите во внимание неинвазивный и недорогой забор мочи.

Этот значительно усовершенствованный метод хорошо подходит для оценки роли 3-нитротирозина в качестве биомаркера окислительного стресса в доклинических и клинических исследованиях.