ODELAY: крупномасштабный метод многопараметрического количественного определения роста дрожжей

Общая цель метода ODELAY заключается в высокопроизводительном измерении фенотипов роста отдельных клеток, развивающихся в колонии. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы микробиологии, генетики и системной биологии, такие как влияние генетических пертурбаций и лекарственных взаимодействий на фенотипы роста любого колониеобразующего микроорганизма. Основным преимуществом ODELAY является то, что он позволяет исследователю напрямую наблюдать и количественно оценивать гетерогенность популяции среди большого количества отдельных особей.

Перед сборкой формы для агара очистите акриловые формы 70% ethanol и высушите их с помощью сжатого воздуха. Форма состоит из трех нижних и двух вертикальных деталей. Для начала сборки формы для агара возьмите три нижние детали и соберите их так, чтобы две идентичные детали зажимали третью деталь с двух сторон.

Используйте два маленьких зажима для скрепления деталей основания с каждой стороны. Установите вертикальные стойки в форму, убедившись, что кривизна лазера расположена правильно. Поместите очищенное и высушенное предметное стекло на форму и удерживайте его, устанавливая второе предметное стекло с другой стороны.

Зафиксируйте сборку большим биндер-клипом. Закрепите оба предметных стекла большими биндер-клипами, убедившись, что каждый верхний клип соприкасается со стеклом в месте его перекрытия с акрилом. Перед заполнением собранной формы расплавленным агаром обеспечьте герметичность краев, пипетируя около 70 microliters расплавленной агаровой среды вдоль внутренней стороны формы.

Заполните форму, медленно дозируя расплавленный агар пипеткой вдоль края формы, чтобы внутри не образовались пузырьки воздуха. После заполнения формы дайте ей остыть при температуре окружающей среды около 23 °C в течение 40-60 минут. Следующим этапом является извлечение из формы.

Начните с того, что снимите нижний зажим для бумаг. Затем извлеките нижнюю часть формы, состоящую из трех скрепленных между собой деталей. Удерживайте предметные стекла, сжимая их, после чего осторожно снимите зажимы для бумаг.

Поместите форму на край лабораторного стола так, чтобы сторона с синей точкой была обращена вверх. Расположите оба больших пальца под акрилом, а указательные пальцы — сверху, ближе к внутреннему краю формы; медленно и осторожно надавите большими пальцами на форму, как если бы вы поворачивали проставку формы вокруг ее нижнего края. Прикладывайте постоянное, но медленно возрастающее давление.

Вдоль линии, где верхнее стекло прижимает прокладку формы, должен появиться разлом и пузырек воздуха. После появления начальной линии разлома продолжайте давить обоими большими пальцами, прикладывая постоянное усилие. Агар должен начать отделяться от стекла.

Продолжайте поворачивать форму вверх. Как только стекло полностью освободится, возьмите его и окончательно извлеките из формы. Затем снимите вторую часть формы аналогичным движением, чтобы поднять её, не смещая агар.

Поместите предметные стекла в стерильный бокс для наконечников, на дно которого налито немного стерильной воды высокой степени очистки. Закройте бокс и храните при температуре 4 °C в течение ночи для использования на следующий день. Начните выполнение данной процедуры с подготовки штаммов в 96-луночном планшете, как описано в текстовом протоколе.

Используйте планшетный ридер для измерения оптической плотности каждой культуры при 600 нанометрах. Затем примените протокол автоматического разведения, чтобы довести оптическую плотность культур в планшете при 600 нанометрах примерно до 0.1. После настройки программы разведения установите планшеты, пробирки и наконечники на платформу робота для работы с жидкостями в соответствии со схемой расположения.

Нажмите кнопку воспроизведения, чтобы запустить программу разведения. Выберите необходимое количество наконечников объемом 50 µL и необходимое количество наконечников объемом 300 µL. По завершении разведения извлеките планшет для разведения из робота и инкубируйте его при 30 °C в течение пяти-шести часов, поддерживая влажность для предотвращения высыхания планшета.

Примерно за один-два часа до завершения инкубации культуральной чашки включите инкубационные камеры микроскопа и дайте им стабилизироваться при 30 °C. Проведите повторное разведение культуры до оптической плотности 0,01–0,02 при 600 нм, используя тот же протокол автоматического разведения. Закройте планшет с разведениями металлической герметичной крышкой для морозильника и подвергните ультразвуковой обработке в ледяной бане в течение 30 секунд, поместив планшет в ледяную воду.

Промаркируйте четыре 96-луночные плоские планшеты как один, два, три и четыре. Перенесите по 150 µL каждой соницированной культуры из планшета с разведениями в плоские планшеты согласно следующей схеме: содержимое лунок от A1 до D6 — в лунки от C4 до F9 Планшета один.

Лунки A7–D12 перенесите в лунки C4–F9 Платины 2. Лунки E1–H6 перенесите в лунки C4–F9 Платины 3. И лунки E7–H12 перенесите в лунки C4–F9 Платины 4.

Для начала данной процедуры правильно установите агарозный слайд в камеру для слайдов. Затем расположите на столе 96-луночные планшеты с плоским дном в соответствии с их квадрантами: планшеты один, два, три и четыре слева направо.

Разместите наконечники в четырех пустых штативах таким образом, чтобы внутренние 24 лунки каждого штатива были заполнены наконечниками. В пятом штативе установите наконечник в позицию C10, а наконечники с обрезанными концами — в позиции A1, A12, H1 и H12. Эти четыре обрезанных наконечника обеспечат устойчивость зажима для планшета с наконечниками.

Поместите первый наконечник-пробойник в начальную точку программы управления роботом-споттером, чтобы проделать отверстие в агарозе, которое будет использоваться позже для выравнивания начальной координаты. Установите Пластину 1 на робот для работы с жидкостями для нанесения образцов в первый квадрант. Снимите крышку и продолжите выполнение программы споттинга.

Убедитесь, что все пятна нанесены. Выбросьте использованные наконечники в контейнер для биоопасных отходов и установите на робот новые наконечники. Подождите около 30 секунд, пока пятна не высохнут до диаметра примерно один миллиметр, после чего продолжите выполнение программы.

Замените Плитку Один на Плитку Два и продолжите программу нанесения образцов. Когда во всех четырех квадрантах будут нанесены образцы и пятна высохнут, установите на место крышку камеры для предметного стекла и переверните аппарат. Поместите предметное стекло на верхнюю сторону камеры для предметного стекла.

Сначала установите камеру предметного стекла в микроскоп. Таймлапс-микроскопия выполняется с помощью специально разработанного скрипта. Нажмите на кнопку затвора, чтобы открыть затвор проходящего света, а затем нажмите кнопку фокусировки, чтобы активировать высокую частоту съемки камеры.

Нажмите «Go Origin» и переместите столик, чтобы найти метку начала координат, пробитую в агаре, затем немного сместитесь вправо, чтобы сфокусироваться на клетках, нанесенных в области E7. Вернитесь к метке начала координат и центрируйте ее в поле зрения. Установите начало координат на это значение, нажав кнопку «Set». Переместитесь в позицию H18 и сфокусируйтесь с помощью шестигранного винта, расположенного ближе всего к этой точке.

Затем перейдите в позицию L7 и выполните фокусировку с помощью шестигранного винта, расположенного ближе всего к этой точке. В завершение перейдите в позицию E7 и выполните фокусировку с помощью шестигранного винта, расположенного ближе всего к этой точке. Проверьте фокус в центре и по краям в точках E12, H12 и L12; отрегулируйте диапазон автофокусировки, если значения z для фокуса, указанные в значении z, выходят за пределы диапазона автофокусировки (плюс или минус).

Нажмите кнопку «Reset», затем нажмите «ODELAY». Выберите каталог для сохранения данных. Микроскоп будет собирать данные в течение 48 часов или до закрытия программы.

На этих репрезентативных изображениях таймлапс-съемки показан рост клеток дрожжей на твердой среде в моменты времени 0, 3, 6 и 9 часов после нанесения капель. Здесь представлен репрезентативный набор данных, сравнивающий два штамма дрожжей после обработки изображений таймлапс-съемки. Относительно равномерное время удвоения свидетельствует о качественном приготовлении агарозного предметного стекла, однако время лаг-фазы значительно варьируется из-за неоптимальных настроек автофокуса.

Здесь представлен более согласованный набор данных, в котором все времена удвоения, по всей видимости, хорошо перекрываются, а лаг-периоды выглядят стабильными. После освоения метода настройка ODELAY может быть выполнена за три-четыре часа при условии правильного соблюдения процедуры. Наиболее критическими этапами для получения воспроизводимых результатов измерений ODELAY являются единообразное приготовление сред и предотвращение механической деформации среды при разделении предметных стекол.

ODELAY представляет собой очень чувствительный метод анализа. Например, с его помощью можно наблюдать дефекты роста температурно-чувствительных штаммов дрожжей при комнатной температуре, в то время как при использовании стандартных методов анализа путем посева каплей (spot assays) для выявления дефекта роста требуется культивирование дрожжей при 37 °C. Несмотря на то, что метод ODELAY был разработан для дрожжей, он применим к любому колониеобразующему организму, включая патогены, что позволяет исследовать широкий спектр условий окружающей среды и генетических факторов для понимания поведения микроорганизмов.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как проводить ODELAY для измерения фенотипов роста одноклеточных микроорганизмов, образующих колонии на твердых средах. Не забывайте, что работа с микроорганизмами может быть опасной, поэтому всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование средств индивидуальной защиты, подходящих для изучаемых организмов.