ODELAY: крупномасштабный метод многопараметрического количественного определения роста дрожжей

Общая цель ODELAY заключается в измерении фенотипов роста отдельных клеток, растущих в колонии с высокой пропускной способностью. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы микробиологии, генетики и системной биологии, такие как влияние генетических возмущений и лекарственных взаимодействий на фенотипы роста любого колониеобразующего микроорганизма. Основное преимущество ODELAY заключается в том, что он позволяет исследователю непосредственно наблюдать и количественно оценивать популяционную гетерогенность среди большого числа особей.

Перед сборкой формы для агара очистите акриловые формы с 70% этанолом и высушите их с помощью принудительного воздуха. Есть три нижние части и две вертикальные части. Чтобы начать сборку формы для агара, возьмите три нижние детали и соберите их так, чтобы две одинаковые части слипнулись с третьей частью.

Используйте два небольших зажима для связывания, чтобы зажать базовые части с каждой стороны. Поместите стойки в форму, убедившись, что лазерная кривая расположена правильно. Поместите очищенное и высушенное предметное стекло на форму и удерживайте его на месте, поместив второе предметное стекло с другой стороны.

Зажмите узел более крупным связующим зажимом. Зажмите оба предметных стекла более крупными связующими зажимами, убедившись, что каждый верхний зажим переплета соприкасается со стеклянным предметным стеклом, перекрывающим акрил. Перед заполнением собранной формы расплавленным агаром убедитесь, что края запечатаны пипетированием около 70 микролитров расплавленного агарового материала вдоль внутренней стороны формы.

Заполните форму, не задерживая пузырьки воздуха внутри, медленно пипетируя расплавленный агар по краю формы. После того, как форма будет заполнена, дайте ей остыть при температуре окружающей среды около 23 градусов Цельсия в течение 40-60 минут. Следующим этапом является отделение пресс-формы.

Начните со снятия нижнего зажима для связующего. Затем снимите нижнюю часть формы, которая состоит из трех прослоенных частей. Удерживайте слайды, сжимая их, а затем осторожно снимите зажимы для переплета.

Поместите форму на край столешницы так, чтобы сторона формы с синей точкой была обращена вверх. Поместите оба больших пальца под акрил, а первые пальцы сверху по направлению к внутреннему краю формы и медленно и осторожно надавите большими пальцами вверх на форму, как бы поворачивая прокладку формы вокруг ее нижнего края. Применяйте постоянное, но медленно увеличивающееся давление.

Разрыв и пузырь воздуха должны появиться вдоль линии, где верхнее стекло закрывает распорку формы. Увидев начальную линию прорыва, продолжайте нажимать вверх обоими большими пальцами и прилагайте постоянное давление. Агар должен начать отламываться от стекла.

Продолжайте поворачивать форму вверх. Когда стекло поступит совершенно свободно, возьмите его и полностью выньте из формы. Затем удалите другую формовочную деталь аналогичным движением, чтобы освободить кусок, не перемещая агар.

Поместите предметные стекла в стерильную коробку для чаевых с небольшим количеством стерильной воды высокой чистоты на дне. Закройте коробку и храните при температуре 4 градуса Цельсия в течение ночи для использования на следующий день. Начните эту процедуру с подготовки штаммов в 96-луночном планшете, как описано в текстовом протоколе.

Использование планшетного ридера для измерения оптической плотности на 600 нанометрах каждой культуры. Затем используйте автоматический протокол разведения для разбавления культур в планшете до оптической плотности на 600 нанометров примерно 0,1. После того, как программа разбавления настроена, загрузите пластины, трубки и наконечники на деку робота для работы с жидкостями, как указано на схеме деки.

Нажмите кнопку воспроизведения, чтобы запустить программу разбавления. Выберите правильное количество насадок по 50 микролитров и правильное количество насадок по 300 микролитров. Когда разбавление будет завершено, снимите пластину для разбавления с робота и культивируйте пластину при температуре 30 градусов Цельсия, поддерживая влажность, чтобы предотвратить высыхание пластины в течение пяти-шести часов.

Примерно за один-два часа до полной инкубации культуральной тарелки включают инкубационные камеры для микроскопа и позволяют им уравновеситься при температуре 30 градусов Цельсия. Разбавьте культуру во второй раз до оптической плотности на 600 нанометрах от 0,01 до 0,02, используя тот же протокол автоматического разбавления. Накройте пластину для разбавления металлическим уплотнением морозильной камеры и проведите ультразвуковую обработку на ледяной бане в течение 30 секунд, плавая пластиной в ледяной воде.

Промаркируйте четыре пластины с плоским дном 96 лунок как одну, две, три и четыре. Перенесите по 150 микролитров каждой ультразвуковой культуры с планшета для разбавления на планшеты с плоским дном, следуя этой схеме. Скважины от A1 до D6 в скважины C4 до F9 первой пластины.

Скважины от A7 до D12 в скважины C4 до F9 второй пластины. Скважины от E1 до H6 в скважины C4 - F9 третьей пластины. И скважины от E7 до H12 в скважины C4 до F9 четвертой пластины.

Чтобы начать эту процедуру, правильно поместите агарозное стекло в камеру затвора. Затем положите на стол 96 пластин с плоским дном в порядке их квадранта. Листы первая, вторая, третья и четвертая слева направо.

Разложите кончики в четырех пустых коробках для чаевых так, чтобы внутренние 24 лунки каждой коробки для чаевых были заняты кончиками. В пятую коробку поместите наконечник в положение C10 и наконечники с отрезанным концом в положения A1, A12, H1 и H12. Эти четыре отрезанных наконечника обеспечат устойчивость зажима пластины наконечника.

Поместите первый пробойник в начальную точку программы обнаружения роботизированного управления, чтобы пробить отверстие в агарозе, которое позже будет использовано для выравнивания исходной координаты. Поместите первую пластину на робота для работы с жидкостями, чтобы определить первый квадрант. Снимите крышку и продолжите программу удаления кровянистых выделений.

Убедитесь, что все пятна присутствуют. Высыпьте использованные наконечники в контейнер биологической опасности И поместите новые наконечники на робота. Подождите около 30 секунд, пока пятна высохнут примерно до одного миллиметра в диаметре, а затем продолжайте программу.

Поменяйте Пластину Один на Пластину Два и продолжайте программу обнаружения. Когда все четыре квадранта будут обнаружены и пятна высохнут, установите на место крышку камеры скольжения и переверните прибор. Поместите предметное стекло на верхнюю сторону камеры предметного стекла.

Сначала загрузите в микроскоп слайдовую камеру. Покадровая микроскопия выполняется путем запуска специально разработанного сценария. Нажмите на кнопку спуска затвора, чтобы открыть затвор проходящего света, а затем на кнопку фокусировки, чтобы запустить высокую скорость камеры.

Нажмите на Go Origin и переместите сцену, чтобы найти отметку начала координат, которая была пробита на агаре, затем переместитесь немного вправо, чтобы сосредоточиться на ячейках, обнаруженных в области E7. Вернитесь к исходному пуансону и центрируйте его в поле зрения. Установите начало координат в это значение, нажав кнопку "Set". Переместитесь в положение H18 и сфокусируйтесь с помощью ближайшего к этому месту винта с шестигранной головкой.

Затем перейдите в положение L7 и сфокусируйтесь с помощью ближайшего к этому месту винта с шестигранной головкой. Наконец, перейдите в положение E7 и сфокусируйтесь с помощью ближайшего к этому месту винта с шестигранной головкой. Проверьте фокусировку в центре и по краям в точках E12, H12 и L12 отрегулируйте диапазон автофокусировки, если значения z, указанные значением z, больше плюса или минуса диапазона автофокусировки.

Нажмите кнопку «Сброс», а затем нажмите ODELAY. Выберите каталог для сохранения данных. Микроскоп будет собирать данные в течение 48 часов или до тех пор, пока программа не будет закрыта.

Эти репрезентативные покадровые изображения показывают рост дрожжевых клеток на твердой среде через ноль часов, три часа, шесть часов и девять часов после появления кровянистых выделений. Здесь показан репрезентативный набор данных, сравнивающий два штамма дрожжей после обработки изображений с интервальной съемкой. Относительно равномерное время удвоения отражает хорошо подготовленный агарозный слайд, однако время задержки значительно варьируется из-за неоптимальных настроек автофокуса.

Здесь показан более согласованный набор данных, в котором все времена удвоения хорошо перекрываются, а времена задержки кажутся постоянными. После освоения настройки ODELAY можно выполнить за три-четыре часа, если она выполнена правильно. Наиболее важными шагами для повторяемых измерений ODELAY являются последовательная подготовка среды и предотвращение механической деформации среды при разделении стекол.

ODELAY является очень чувствительным анализом. Например, он может наблюдать дефекты роста чувствительных к температуре штаммов дрожжей при комнатной температуре, тогда как обычно используемые точечные анализы требуют культивирования дрожжей при температуре 37 градусов по Цельсию для выявления дефекта роста. Несмотря на то, что ODELAY был разработан для дрожжей, этот метод применим к любому колониеобразующему организму, включая патогены, для изучения широкого спектра условий окружающей среды и генетических условий для понимания поведения микроорганизмов.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить ODELAY для измерения фенотипов роста одноклеточных микроорганизмов, образующих колонии на твердых средах. Не забывайте, что работа с микроорганизмами может быть опасной, и всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение средств индивидуальной защиты, подходящих для изучаемых организмов.