Улучшение приложения высокомолекулярного декстрана биотинилированным Амин Thalamocortical проекции трассировки в крыса

Общая цель этого видео — продемонстрировать усовершенствованный протокол применения высокомолекулярного BDA для изучения оптимальной нейронной маркировки в центральной нервной системе. Эта мера может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейронных сетей. Визуализируя фреймовую структуру нейронной маркировки через нейронные цепи.

Основным преимуществом данной методики является то, что она дает возможность запустить локальные нейронные цепи и их химические характеристики. Подготовьте один микролитровый микрошприц, оснащенный стеклянной микропипеткой, и испытайте его, набрав жидкий парафин. После обезболивания крысы по утвержденному протоколу подтвердите глубокую анестезию отсутствием реакции на пощипывание хвоста.

Затем выбрейте макушку головы животного электрической бритвой и потрите место операции 10% повидон-йода, а затем 70% этанола. Закрепите крысу в стереотаксическом устройстве, вставив тупые ушные планки в уши и поместив верхние резцы крысы в держатель рта. Нанесите на глаза офтальмологическую мазь.

Используйте стерильные хирургические перчатки и простыни для поддержания стерильных условий. Снова очистите кожу головы в месте операции, используя 70% этанол. Сделав сагиттальный разрез на коже скальпелем, вдоль сагиттального шва, с помощью стерильных аппликаторов с ватным наконечником соскребите мышцу и надкостницу с черепа.

Используя заранее определенные координаты из атласа, определите место проведения трепанации черепа. Выполните трепанацию черепа с помощью сверла с заусенцами и сверлом с круглым наконечником, чтобы просверлить на глубину около одного миллиметра, пока мозговые оболочки не станут видны. Иссекайте твердую мозговую оболочку с помощью микрощипцов, чтобы обнажить кору головного мозга над местом инъекции.

Излейте жидкий парафин из микрошприца, а затем наберите 10% раствор BDA. Установите шприц в аппарат для микроинъекций и подключите микронасос. Под стереомикроскопом манипуляций с аппаратом для микроинъекций.

Введите наполненную стеклянную микропипетку в ВПМ через кортикальную поверхность головного мозга, на глубину до 5,8 миллиметров. Затем с помощью микронасоса впрыскайте под давлением 100 нанолитров 10% BDA в VPM в течение трех минут. Через пять минут медленно извлеките пипетку.

Зашить рану стерильной нитью, затем поместить крысу в теплую зону восстановления, пока она не придет в сознание и полностью не восстановится. После усыпления крысы с помощью ножниц и щипцов откройте грудную полость крысы и получите доступ к сердцу. Введите внутривенный катетер в левый желудочек по направлению к аорте, а затем откройте правое предсердие.

Сначала перфузируйте 0,9% физиологическим раствором при физиологической температуре в течение одной-двух минут, пока кровь, выходящая из сердца, не станет прозрачной. Затем добавьте от 250 до 300 миллилитров 4% параформальдегида в 0,1 молярного фосфатного буфера. После этого зафиксируйте рассеченный мозг в 4%-ном параформальдегиде в течение двух часов при комнатной температуре.

Затем перевести мозг на 30%-ную сахарозу в 0,1 моляра PBS и криопротектор на три дня при четырех градусах Цельсия. Через три дня, когда мозг погрузится в раствор, разделите мозг на три блока в корональном направлении с помощью мозговой матрицы. Центральный блок содержит вентральное заднемедиальное ядро таламуса в первичной соматосенсорной коре.

Смонтируйте центральный блок мозга на стадии замораживания скользящего микротома для разреза в корональной плоскости и разреза на 40 мкм при замораживании. Соберите срезы в шестилуночную чашку, содержащую 0,1 моляра PBS. Начните окрашивание с полоскания участков в 0,1 моляра PBS в течение примерно одной минуты с покачиванием.

Затем переложите срезы в смешанный раствор стрептавидина-AF594 в зеленом флуоресцентном красителе Ниссля AF500/525 в 0,1 моляра PBS, содержащем 0,3% Triton X-100, и инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре. После окрашивания промыть срезы трижды в 0,1 моляре PB с раскачиванием. Закрепите срезы на предметных стеклах микроскопа с помощью стандартных гистохимических методов.

Просушите срезы на воздухе около часа. Нанесите 50% глицерина в дистиллированной воде на грудные срезы и накройте их перед съемкой предметных стекол. На этой репрезентативной микрофотографии красным цветом показано место инъекции BDA вентрального заднемедиального ядра таламуса на фоне зеленого окрашивания по Нисслю.

Здесь показана торесцентная BDA-маркировка, включающая аксоны таламилакортикола в четвертом слое и корковые таламические нейроны в пятом и шестом слоях. Для сравнения, эта микрофотография демонстрирует, что традиционное BDA-мечение стандартной процедурой авидин-биотинпероксидазы обнаруживает схожую схему нейронного мечения с тщательным BDA-мечением. На этом снимке с увеличенным увеличением массивного участка, меченного BDA, антероградно помеченные аксональные арборы показаны красным цветом.

Здесь подробно показано тело нейронных клеток с ретроградной меткой, дендриты и дендритные шипы. После освоения трепанация черепа и стереотаксическая инъекция могут быть выполнены за 20-30 минут, если они выполнены правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как применять высокомолекулярную BDA для оживления нейронных связей и подробной структуры нейронного мечения.