Живой изображений клеток первичной коры головного мозга, с использованием системы 2D культуры

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы наблюдать за поведением клеток во время эволюции линии от нейральных стволовых клеток к нейронам или глиальным клеткам. Этот метод может помочь ответить на вопросы в области развития нервной системы, такие как роль симметричного и асимметричного деления клеток, удлинение клеточного цикла и скорость роста клеток. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет наблюдать за клеточным происхождением в течение длительных периодов времени.

Это позволяет наблюдать переход от нейрогенеза к глиальному генезу в пределах одной линии и прямое распространение сублинейных нейронных и глиальных предшественников. Начните с удаления мозга от 5 до 10 эмбрионов e14 в чашке Петри с холодной средой для вскрытия. С помощью щипцов осторожно вытяните кожу и череп и изолируйте мозг.

Во время работы под стереомикроскопом используйте рассекционные щипцы для удаления мозговых оболочек. Затем разделите конечный мозг посередине, чтобы разделить полушария. Чтобы изолировать дорсолатеральный конечный мозг, разрежьте вдоль дорсомедиальной кривой и границы паллио и субпаллиума.

Перенесите дорсолатеральные мозговые мозги в трубку объемом 2 мл с диссекционной средой на льду до тех пор, пока не будут рассечены все мозги. После микродиссекции дорсолатерального конечного мозга поместите ткань в коническую трубку объемом 15 мл. Затем центрифугируйте пробирку, содержащую собранную ткань, в холодной среде для рассечения в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и 340 перегрузках для осаждения ткани.

После отжима удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки и добавьте 1мл 37 градусов Цельсия 0,05%Трипсин-ЭДТА для химического переваривания. Выдерживать в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации добавьте 2 мл пролиферативной среды, чтобы подавить активность трипсима.

Далее отполируйте кончик стеклянной пастеровской пипетки над газовой горелкой или горелкой Бунзена в течение нескольких секунд, чтобы немного сузить отверстие. Отчаянно используйте ФКС, чтобы покрыть кончик пипетки. Затем механически диссоциируйте клетки с помощью отполированной огнем пипетки Пастера с покрытием FCS, пипетируя вверх и вниз, стараясь при этом не образовывать пузырьков.

Центрифугируйте диссоциированные клетки в течение пяти минут при температуре 4 градуса Цельсия при 340 градусах Г. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки, затем добавьте один миллиметр пролиферативной среды и повторно суспендируйте клетки с помощью пипетки. Удалите PBS с предварительно обработанной пластины с помощью поли-D-лизина. Затем нарисуйте в нижней части таблички знак, который можно использовать в качестве ориентира для определения нулевой точки.

После повторного суспендирования клеток в пролиферирующей среде готовят разведение клеточной суспензии один к одному с использованием 0,4%-ного раствора трипанового синего. Загрузите в предметные стекла счетной камеры и подсчитайте количество неокрашенных жизнеспособных клеток. Нежизнеспособные клетки будут синего цвета.

Разведите клетки в пролиферирующей среде до получения от 10 до шестой клетки на миллиметр. Добавьте 500 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку 24-луночного планшета для культивирования тканей и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Чтобы визуализировать клетки, трансдуцированные ретровирусом, поместите планшет для культуры ткани в камеру визуализации, подключенную к регуляторам температуры и углекислого газа, чтобы поддерживать клетки в постоянных условиях 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

Выберите положение на оси xy, которое будет служить нулевой точкой, и откалибруйте нулевую точку. Выберите от 10 до 15 положений для каждой лунки, чтобы получить изображение с 10-кратным увеличением. Настройте программное обеспечение так, чтобы фазово-контрастные изображения требовались каждые пять минут, а флуоресцентные изображения — каждые три часа, чтобы снизить фототоксичность.

Проверьте и отрегулируйте фокус в первые три часа эксперимента, так как он может измениться по мере выравнивания температуры. Через семь дней остановите сбор и приступайте к иммуноцитохимии после визуализации. Запустите программу для отслеживания ячеек и выберите имя пользователя.

Нажмите на кнопку «Выберите имя пользователя» и продолжите. Просмотрите и выберите рабочую папку tTt для сохранения деревьев происхождения, статистики и экспортированных изображений. Далее выберите эксперимент для анализа и загрузки.

Если изображения были ранее конвертированы с помощью конвертера tTt, нажмите на конвертер лог-файла и укажите количество секунд между двумя последовательными временными точками в окне конвертера лог-файлов. Нажмите на кнопку «Конвертировать файлы журнала» для всего эксперимента. Выберите и загрузите нужные изображения вручную или с помощью опции, отображаемой в программе.

Выбираем файл, открываем, новая колония. Нажмите на отслеживание, а затем начните отслеживание, чтобы начать отслеживание в выбранной позиции. Появится окно фильма.

Выделите ячейку с помощью круга слежения и нажмите клавишу «ноль». Софт перейдет к следующему кадру. Продолжайте располагать круг отслеживания вокруг ячейки трека с помощью мыши и нажимайте на ноль в каждом кадре, чтобы добавить трек на ячейку.

Используйте клавиши один и три для перехода к предыдущему или следующему кадру. Чтобы удалить след, просто нажмите на правильное положение для метки и нажмите ноль. Если ячейка разделилась, выберите отслеживание, остановите причину, деление и продолжите отслеживание одной дочерней клетки, выбрав одну из ячеек в окне редактора ячеек, затем выберите отслеживание, начните отслеживание.

Чтобы отследить вторую дочернюю ячейку, выделите ее в редакторе ячеек и нажмите F2. Если клетка погибла во время видеомикроскопии, выберите апоптоз. Если ячейка выходит из поля наблюдения или смешивается с соседними ячейками, препятствуя отслеживанию, выберите «Потеряно». Чтобы остановить отслеживание и продолжить позже, нажмите «Прервать».

В окне редактора ячеек во время трекинга будет сгенерировано дерево. Чтобы сохранить дерево родства, выберите файл, сохранить, текущее дерево в окне редактора ячеек. Чтобы экспортировать фильм с данными трекинга, отключите режим трекинга и в окне фильма выберите «Экспортировать фильм».

Настройте диапазон форматов кадров, количество кадров в секунду и скорость передачи данных. Нажмите на кнопку «Начать экспорт». На следующих микрофотографиях показан фазовый контраст на флуоресцентных изображениях GFP культуры клеток первичной коры головного мозга.

Экспрессия GFP отсутствует в течение первых часов визуализации. Количество клеток, экспрессирующих GFP, со временем увеличивается, а интенсивность флуоресценции GFP увеличивается, как показано желтой стрелкой на этих изображениях. Это изображение с большим увеличением в квадратной области предыдущего изображения показывает клетки, экспрессирующие GFP, в деталях.

Эти фазово-контрастные изображения показывают пример деления клеток. Здесь видно округление клеток предшественников, за которым следует сужение клеточной мембраны и, наконец, завершение митоза. Это пример дерева родословной с одной клеткой.

Цветными стрелками обозначены разные режимы деления клеток, симметричное пролиферативное деление показано желтой стрелкой. Асимметричное деление обозначено синей стрелкой. Симметричное терминальное деление показано красной стрелкой, а X указывает на гибель клеток.

Цифрами обозначена длина клеточного цикла клеток-предшественников. Эту технику можно выполнить за один-два часа, если она выполнена правильно. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как показать поведение клеток во время прогрессии клеточной линии для стволовых клеток в нейроны или глиальные клетки.