Поколения родной Chromatin иммунопреципитации секвенирования библиотек для анализа плотности нуклеосома

Общая цель данной процедуры — создание библиотек для нативного иммунопреципитирования хроматина с последующим секвенированием (NCo ChIP-seq) для анализа плотности нуклеосом. Этот метод позволяет ответить на вопросы эпигенетики, такие как выявление эпигеномных особенностей в популяции клеток на уровне отдельных нуклеосом и разложение гетерогенных сигнатур хроматина на их непрерывные элементы. Основным преимуществом данной методики является использование свойства MNase по преимущественному доступу к открытым областям хроматина для получения показателей, сочетающих доступность для MNase с модификацией гистонов.

Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, сталкиваются с трудностями из-за невозможности добиться оптимального переваривания MNase. Начните выполнение протокола с подготовки клеток, как описано в текстовой инструкции. В первый день разморозьте каждый осадок клеток в водяной бане при 37 °C в течение 10 секунд.

Затем перенесите клетки на лед. К каждому осадку клеток немедленно добавьте ледяной 1X лизирующий буфер с добавлением 1X PIC до конечной концентрации 10 000 клеток на 20 µL. Перемешайте содержимое, 10 раз пропипетировав раствор вверх-вниз, избегая образования пузырьков.

Работая на льду, внесите по 20 µL полученных лизатов в каждую лунку планшета на 96 лунок. Накройте планшет пластиковой пленкой перед инкубацией на льду в течение 20 минут. Маркируйте планшет как MNase и занесите данные о лунках в шаблон-ключ.

Незадолго до завершения 20-минутного лизиса разведите фермент MNase one буфером для разведения MNase one до конечной концентрации 20 units/µL и храните его на льду. Работая на льду, приготовьте основную смесь (master mix) для переваривания MNase one, как описано в текстовом протоколе. Затем распределите по 20 µL основной смеси на каждый ряд образцов, добавив пять µL дополнительного объема в резервуарный планшет на 96 лунок.

После завершения инкубации лизатов достаньте планшет для переваривания MNase со льда. С помощью многоканального дозатора внесите по 20 µL мастер-смеси для первого переваривания MNnase в каждый ряд образцов и перемешайте, выполнив пипетирование вверх-вниз 10 раз. Меняйте наконечники между рядами.

Затем инкубируйте планшет при комнатной температуре ровно пять минут. Чтобы остановить реакцию через пять минут, с помощью многоканального дозатора внесите 6 µL 250 µM EDTA в каждый ряд образцов и несколько раз перемешайте содержимое путем аспирации и диспенсирования. Обязательно меняйте наконечники при переходе от одного ряда к другому.

После добавления EDTA установите объем пипетки на 20 microliters и перемешайте содержимое 10 раз, как и прежде, чтобы обеспечить полное прекращение реакции переваривания. В завершение добавьте по six microliters 10X лизирующего буфера в каждый ряд образцов, подвергнутых перевариванию MNase, и тщательно перемешайте, произведя 10 циклов аспирации и диспенсирования. Накройте планшет пластиковой пленкой и инкубируйте на льду в течение 15 minutes.

Подготовьте планшет с комплексом антитело-бисер и планшет для предварительной очистки согласно текстовому протоколу. Коротко центрифугируйте оба планшета в течение 10 секунд при 200 ×g. Затем поместите планшет с комплексом антитело-бисер на магнит для планшетов и подождите 15 секунд, пока раствор не станет прозрачным. Осторожно удалите и утилизируйте супернатант с помощью пипетки, не затрагивая бисеры.

Затем снимите планшет с магнитного сепаратора и поместите его на лед. Поместите планшет с реакцией предварительного очищения на магнитный сепаратор и подождите 15 секунд, пока гранулы не осядут, а раствор не станет прозрачным. Не затрагивая гранулы, с помощью пипетки осторожно перенесите супернатант в соответствующие лунки планшета с комплексом антитело-гранула, который находится на льду.

Осторожно перемешайте содержимое каждой лунки, 15 раз пропипетировав жидкость вверх-вниз. Плотно закройте планшет алюминиевой крышкой и инкубируйте в течение ночи при температуре 4 °C на ротаторе. После инкубации подпишите планшет как «IP Reaction».

На второй день установите температуру нагревающего смесителя на 65 °C, затем приготовьте на льду промывочный буфер с низкой концентрацией соли и промывочный буфер с высокой концентрацией соли. Кратковременно центрифугируйте планшет для IP-реакции в течение 10 секунд при 200 ×g. Поместите планшет для IP-реакции на магнитный штатив и подождите 15 секунд до полного осветления раствора. С помощью многоканального дозатора, не затрагивая гранулы, осторожно удалите и утилизируйте супернатант.

Снимите планшет с магнитного сепаратора и поместите его на лед. В каждую строку образцов в планшете для ИП-реакции добавьте 150 µL ледяного промывочного буфера с низким содержанием соли и осторожно перемешайте содержимое вверх-вниз 10 раз для полного ресуспендирования гранул. Снова поместите планшет для ИП-реакции на магнитный сепаратор и удалите супернатант, как описано ранее.

Затем снова поместите планшет на лед и повторите этапы промывки, чтобы в общей сложности было проведено две промывки. Работая на льду, добавьте 150 µL буфера для промывки с высоким содержанием соли в каждый ряд образцов в планшете для реакции IP. Осторожно перемешайте образцы, 10 раз пропипетируя содержимое вверх-вниз для полного ресуспендирования бусин.

После удаления супернатанта, как и прежде, поместите планшет для реакции IP на лед и предварительно охладите рядом с ним новый 96-луночный планшет. В каждую строку образцов в планшете для реакции IP добавьте 150 µL буфера для промывки с высоким содержанием соли и осторожно перемешайте содержимое, 10 раз пропипетируя его вверх-вниз для полного ресуспендирования гранул. После ресуспендирования перенесите каждую строку образцов в соответствующую строку нового предварительно охлажденного 96-луночного планшета.

Утилизируйте старый планшет. Поместите новый планшет для реакции IP на магнитный штатив и слейте супернатант, как и прежде. Храните планшет при комнатной температуре.

В каждый ряд образцов на планшете для реакции IP добавьте 30 µL буфера для элюции ChIP и осторожно перемешайте, 10 раз прокачав содержимое пипеткой. Следите за тем, чтобы не образовывались пузырьки. Закройте планшет крышкой для ПЦР и инкубируйте в термомиксере при 65 °C в течение 1,5 часов при скорости перемешивания 1 350 RPM.

После инкубации в течение 1,5 часов центрифугируйте планшет с реакционной смесью для IP при 200 ×g в течение одной минуты при температуре 4 °C. Затем поместите планшет с реакционной смесью для IP на магнитную платформу и подождите, пока раствор не станет прозрачным. С помощью многоканального дозатора, не затрагивая гранулы, осторожно перенесите 20 µL супернатанта в новый 96-луночный планшет, используя новые наконечники для каждого ряда.

Маркируйте планшет как «Реакция IP» и выдержите его при комнатной температуре. Перейдите к перевариванию белков с последующим конструированием библиотеки, как описано в текстовом протоколе. Здесь представлены репрезентативные результаты оптимального, недостаточного и избыточного переваривания хроматина MNase перед генерацией библиотеки.

Профиль оптимального переваривания характеризуется преобладанием фрагментов размером в один нуклеосомный комплекс, при этом переваривание не должно быть избыточным, чтобы обеспечить возможность выделения фрагментов более высокого порядка. Субоптимальное переваривание хроматина также будет заметно по профилю секвенируемой библиотеки, полученной из материала после иммунопреципитации (IP). Для валидации библиотек с помощью qPCR оценивали кратность обогащения библиотек IP по отношению к входной библиотеке для положительных и отрицательных мишеней.

Кроме того, при анализе выровненных ридов библиотек с высоким показателем обогащения, определенным с помощью qPCR, в геномном браузере должны быть визуально заметны области обогащения по сравнению с контрольной библиотекой (input). Успешно подготовленные библиотеки для ChIP-seq плотности нуклеосом будут содержать высококоррелированные реплики, при этом значительная часть выровненных ридов будет сосредоточена в пиках обогащения, идентифицированных с помощью MACS2. После освоения данной методики ее выполнение при соблюдении всех правил занимает два дня.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создавать библиотеки для нативного иммунопреципитационного секвенирования хроматина с целью анализа плотности нуклеосом. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости оптимального переваривания хроматина и использовать только те антитела, которые обладают высоким сродством к интересуемому эпитопу и проявляют низкую или отсутствующую перекрестную реактивность с другими эпитопами. После выполнения этой процедуры можно провести компьютерное моделирование доступности MNase, чтобы ответить на такие вопросы, как эпигенетические признаки, обусловленные гетерогенностью внутри клеточной популяции.

Данный метод позволяет изучить комбинированный эффект положения нуклеосом и их локальной плотности, а также посттрансляционные модификации их гистоновых субъединиц; он может быть применен к любым системам, таким как клетки человека или мыши, первичные клетки и замороженные ткани.