Поколения родной Chromatin иммунопреципитации секвенирования библиотек для анализа плотности нуклеосома

Общей целью этой процедуры является создание нативных библиотек иммунопреципитационного секвенирования хроматина для анализа плотности нуклеосом. Этот метод может ответить на такие вопросы эпигенетики, как выявление эпигеномных особенностей в клеточной популяции на уровне одного нуклеосомы и разложение гетерогенных сигнатур хроматина на их непрерывные элементы. Основное преимущество этого метода заключается в использовании свойства MNазы о преимущественном доступе к открытой области хроматина для получения измерения, сочетающего доступность MNазы с модификацией гистонов.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что они не в состоянии получить оптимальное переваривание MNазы. Начните этот протокол с препарирования клеток, как описано в текстовом протоколе. В первый день разморозьте каждую клеточную гранулу на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 секунд.

Затем переложите клетки в лед. К каждой клеточной грануле немедленно добавьте ледяной буфер для лизиса one-X плюс один X PIC до конечной концентрации 10 000 клеток на 20 микролитров. Перемешайте 10 раз, пипетируя вверх и вниз, не образуя пузырьков.

Работая на льду, аликвотировать 20 микролитров на лунку полученных лизатов в 96-луночный планшет. Накройте пластину пластиковой пломбой перед инкубацией на льду в течение 20 минут. Пометьте пластину как MNase и запишите лунки в ключ шаблона.

Непосредственно перед завершением 20-минутного лизиса разбавьте фермент MNase one буфером для разведения MNase one до конечной концентрации 20 единиц на микролитр и держите его на льду. Работая на льду, приготовьте мастер-смесь MNase one digestion, как описано в текстовом протоколе. Затем распределите 20 микролитров мастер-смеси на каждый ряд образцов, плюс пять микролитров дополнительного объема в 96-луночную резервуарную пластину.

лизаты закончат инкубацию, снимите со льда пластину для разложения MNase. С помощью многоканальной пипетки добавьте 20 микролитров MNnase one digestion master mix в каждый ряд образцов и перемешайте с помощью пипетирования вверх и вниз 10 раз. Меняйте кончики между рядами.

Затем выдержите тарелку при комнатной температуре ровно пять минут. Чтобы остановить реакцию через пять минут, с помощью многоканальной пипетки добавьте шесть микролитров 250-микромолярной ЭДТА в каждый ряд образцов и перемешайте несколько раз. Обязательно меняйте кончики между рядами.

После добавления ЭДТА измените настройку пипетки на 20 микролитров и перемешайте 10 раз, как и раньше, чтобы обеспечить полную остановку реакции пищеварения. Наконец, добавьте шесть микролитров 10-кратного буфера для лизиса в каждую строку переваренных образцов MNазы и хорошо перемешайте, пипетируя вверх и вниз 10 раз. Накройте тарелку пластиковым уплотнителем и выдерживайте на льду в течение 15 минут.

Подготовьте комплексную пластину для гранул антител и пластину для предварительного очищения, как описано в текстовом протоколе. Быстро вращайте обе пластины, центрифугируя в течение 10 секунд при 200-кратном G. Затем поместите сложную пластину с шариками антител на пластинчатый магнит и подождите 15 секунд, пока раствор не станет прозрачным. Осторожно извлеките и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки, не повреждая шарики.

Затем снимите пластину с магнита и держите ее на льду. Поместите реакционную пластину для предварительной очистки на пластинчатый магнит и подождите 15 секунд, пока шарики разойдутся и раствор станет прозрачным. Не тревожа бусины, с помощью пипетки осторожно перенесите надосадочную жидкость в соответствующие лунки комплекса бусин антител, которые держатся на льду.

Аккуратно перемешайте каждую лунку, пипетируя вверх и вниз 15 раз. Хорошо закройте пластину алюминиевой крышкой и инкубируйте в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия на вращающейся платформе. После инкубации перемаркируйте планшет маркировкой IP Reaction.

На второй день установите нагревательный смеситель на 65 градусов Цельсия, затем приготовьте буфер для промывки с низким содержанием соли и буфер для промывки с высоким содержанием соли на льду. Быстро вращайте реакционную пластину IP в течение 10 секунд с кратностью 200 °G. Поместите реакционную пластину IP на пластинчатый магнит и подождите 15 секунд, пока раствор не станет прозрачным. С помощью многоканальной пипетки, не тревожа шарики, аккуратно извлеките и выбросьте надосадочную жидкость.

Снимите пластину с магнитной пластины и положите ее на лед. К каждому ряду образцов в реакционной пластине IP добавьте 150 микролитров ледяного буфера для промывки с низким содержанием соли и медленно перемешайте вверх и вниз 10 раз, чтобы полностью суспендировать шарики. Поместите реактивную пластину IP обратно на пластинчатый магнит и удалите надосадочную жидкость, как и раньше.

Затем поставьте тарелку обратно на лед и повторите шаги стирки в общей сложности два стирки. Работая со льдом, добавьте 150 микролитров промывочного буфера с высоким содержанием соли в каждый ряд образцов в реакционной пластине IP. Медленно перемешивайте образцы, пипетируя вверх и вниз 10 раз, чтобы полностью суспендировать шарики.

После удаления надосадочной жидкости, как и раньше, поместите реакционную пластину IP на лед и предварительно охладите новую 96-луночную пластину рядом с ней. В каждый ряд образцов в реакционной пластине IP добавьте 150 микролитров промывочного буфера с высоким содержанием соли и медленно перемешайте 10 раз, пипетируя вверх и вниз, чтобы полностью восстановить гранулы. После ресуспензии переложите каждый ряд образцов в соответствующий ряд нового, предварительно охлажденного 96-луночного планшета.

Выбросьте старую тарелку. Поместите новую реактивную пластину IP на пластинчатый магнит и выбросьте надосадочную жидкость, как и раньше. Держите тарелку при комнатной температуре.

К каждому ряду образцов в реакционной пластине IP добавьте 30 микролитров элюирующего буфера ChIP и медленно перемешайте, пипетируя вверх и вниз 10 раз. Следите за тем, чтобы не допустить образования пузырьков. Запечатайте планшет крышкой PCR и инкубируйте в нагревательной смесителе при температуре 65 градусов Цельсия в течение 1 1/2 часа со скоростью смешивания 1, 350 об/мин.

После 1,5-часовой инкубации поверните реакционную пластину IP при 200-кратном G в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия. Затем поместите реакционную пластину IP на пластинчатый магнит и подождите, пока раствор исчезнет. С помощью многоканальной пипетки, не тревожа шарики, аккуратно переложите 20 микролитров надосадочной жидкости в новую 96-луночную пластину, используя свежие наконечники для каждого ряда.

Пометьте пластину маркировкой IP Reaction и держите ее при комнатной температуре. Приступаем к перевариванию белка с последующим построением библиотеки, как описано в текстовом протоколе. Здесь представлены репрезентативные результаты оптимального, недоваренного и переваренного хроматина МНазы до генерации библиотеки.

В оптимально усваиваемом профиле преобладают размеры фрагментов нуклеосом, но они не перевариваются, чтобы обеспечить восстановление фрагментов нуклеосом более высокого порядка. Неоптимальное расщепление хроматина также будет очевидно в профиле библиотеки секвенирования, сгенерированной из материала IP. Для валидации библиотек методом количественной ПЦР оценивалось кратное обогащение IP-библиотек по отношению к входной библиотеке для положительных и отрицательных целей.

Кроме того, изучение выровненных прочтений библиотек с высоким кратным обогащением с высокой количественной ПЦР в браузере генома должно выявить визуально обнаруживаемое обогащение по сравнению с входной библиотекой. Успешные библиотеки ChIP-секвенирования плотности нуклеосом будут содержать высококоррелированные репликаты со значительной долей выровненных прочтений в пределах обогащенных пиков, идентифицированных MACS2. После освоения этой техники ее можно сделать за два дня, если она выполнена правильно.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как генерировать нативные библиотеки иммунопреципитационного секвенирования хроматина для анализа плотности нуклеосом. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что хроматин оптимально усваивается, и использовать только те антитела, которые демонстрируют высокое сродство к интересующему эпитопу и проявляют незначительную перекрестную реактивность или не проявляют ее вовсе с другими эпитопами. После этой процедуры можно выполнить вычислительное моделирование доступности MNase, чтобы ответить на такие вопросы, как эпигенетические сигнатуры из-за гетерогенности в популяции клеток.

Этот метод дает представление о комбинаторном эффекте положения нуклеосом и локальной плотности, а также посттрансляционной модификации их гистонных субъединиц и может быть применен к любым системам, таким как человеческая или мышиная, первичным клеткам и замороженным тканям.