Вскрытие и подготовка корональных срез развития гипофиза мыши

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы добиться правильных участков короны гипофиза с хорошо сохранившейся архитектурой тканей развивающихся мышей. Эта процедура может помочь ответить на ключевые вопросы в области развития гипофиза, такие как гистология гипофиза, дифференцировка клеток, пролиферация и апоптоз. Основное преимущество этой методики заключается в том, что развивающиеся гипофизы мышей можно рассекать без видимых повреждений и правильно ориентировать для достижения корональных сечений.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы обнаружили, что для развития гипофиза мышей технически сложно получить правильные корональные сечения. После обезболивания и фиксации мышей согласно текстовому протоколу с помощью ножниц разрезают кость черепа. Далее с помощью щипцов аккуратно приподнимите задний мозг от основания черепа.

Затем, при первых признаках турецкого седла, прекратите подъем, но задержите задний мозг, и с помощью тонких ножниц перережьте стебель гипофиза и нервные волокна, соединенные с основанием мозга. Продолжайте подтягивать и удалять весь мозг, чтобы полностью обнажить гипофиз. Гипофиз опирается на дорсальную поверхность клиновидной кости и окружен с боков тройничными нервами.

Затем с помощью ножниц разрежьте всю селлярную область, включая гипофиз, боковые тройничные нервы и под клиновидной костью. Поместите салфетку в чашку диаметром 35 мм, содержащую 4% PFA, и инкубируйте ее при температуре 4 градуса Цельсия в течение от 40 минут до 3 часов, в зависимости от возраста. Затем используйте 10 мл PBS для промывания неподвижной ткани в течение пяти смен по 15 минут каждая.

Перенесите неподвижную ткань в чашку диаметром 35 мм, содержащую 1 мл PBS, и под стереомикроскопом диссоциируйте гипофиз. Для гипофиза от П5 до Р14 с помощью тонких щипцов и ножниц удаляют соединительные оболочки между нервами и костью, а также осторожно изолируют гипофиз вместе с боковыми тройничными нервами в целом, но оставляя турецкое седло. Для гипофиза P21 и взрослых удалите нервы и соединительные оболочки вокруг гипофиза, а также освободите железу от окружающих тканей.

После обезвоживания, очистки от ксилола и инфильтрации воска, выполненной в соответствии с текстовым протоколом, на системе консоли для встраивания ткани извлеките образец из кассеты и поместите его в форму основания, наполовину заполненную расплавленным парафином. Для гипофиза P21 и взрослого человека используйте подогретые тонкие щипцы, чтобы расположить гипофиз так, чтобы его короткая ось была перпендикулярна нижней поверхности формы основания. Для гипофиза P0–P4 ориентируйте образцы так, чтобы их клиновидные кости были перпендикулярны нижней поверхности формы основания.

Для гипофиза от P5 до P14 ориентируйте образцы так, чтобы их тройничные нервы были перпендикулярны нижней поверхности формы основания. После позиционирования железы с помощью подогретых тонких щипцов аккуратно удерживайте ткань в нужном положении до тех пор, пока воск не станет полутвердым на охлаждающей пластине. Долейте в форму расплавленный парафин.

Дайте парафиновому блоку остыть до полного застывания воска. Охладите парафиновый блок при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение 10-20 минут, затем с помощью микротома нарежьте его тонкими ломтиками, точно регулируя положение парафинового блока во время разрезания. Проводят иммуномаркировку согласно текстовому протоколу.

Как показано на рисунке, для рассечения гипофиза у неонатальной мыши вся селлярная область, содержащая гипофиз, тройничные нервы и клиновидную кость под ним, была отделена от основания черепа. Крошечный и нежный гипофиз оставался неповрежденным во время процесса. У мышей старше пяти дней гипофиз, прикрепленные к боковым тройничным нервам, были изолированы.

Структура роста гипофиза, выделенного от мыши P7, хорошо сохранилась. Здесь гипофиз мыши P21 был успешно изолирован без видимых повреждений при удалении окружающей его ткани. На этом рисунке H&E окрашивание правильно ориентированных корональных срезов демонстрирует хорошо сохранившуюся морфологию как аденогипофиза, так и нейрогипофиза в гипофизе P0, P7 и P21.

Наконец, обработанные слайды также были совместимы с иммунофлуоресцентным мечением. Например, у аденогипофиза и нейрогипофиза наблюдалась специфическая иммуномаркировка ГР и ГФАП соответственно. После освоения процесс от вскрытия до встраивания может быть выполнен за 7,5 часов у взрослых мышей и еще меньше у молодых мышей, если он выполнен правильно.

При попытке этой процедуры важно помнить о рассечении всей подсылочной области, чтобы избежать прикосновения к гипофизу любыми хирургическими инструментами. После этой процедуры гипофиз без префикса также может быть изолирован. В этом случае следует проявлять большую осторожность, чтобы избежать нежелательных повреждений.

Железа также должна быть рассечена как можно быстрее. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как рассекать гипофиз мышей и препарировать корональные отделы гипофиза на разных стадиях развития.