Всеобъемлющий протокол выборки и процесс костного мозга для измерения поддающихся оценке остаточной болезни и лейкозных клеток острой миелоидной лейкемией

Общая цель данного протокола заключается в проведении точного тестирования образцов костного мозга пациентов с острым миелоидным лейкозом на измеримую остаточную болезнь, включая количественную оценку стволовых клеток лейкемии. Этот метод может обеспечить точную оценку измеримой остаточной болезни в образцах костного мозга пациентов с острым миелоидным лейкозом. Основное преимущество этого подхода заключается в том, что тщательное следование протоколу дает высоковоспроизводимые и высококачественные результаты.

Применение этого метода распространяется на принятие клинических решений, поскольку он может быть использован в качестве считывания реакции пациентов на лечение. Демонстрировать процедуры будут гематолог Йерун Янссен, техник диагностической гематологической лаборатории Геррит Сейм, а также Дженнифер Шейк и Сандер Снель, техники команды MRD. Когда пациент находится в боковом положении пролежня, отметьте ручкой верхний задний подвздошный отдел позвоночника и продезинфицируйте кожу предполагаемой области биопсии от 0,5 до 1% хлоргексидина в этаноле круговыми движениями наружу.

После введения местного анестетика возьмите иглу 15-го калибра 2,8 дюйма с проксимальным концом на ладони, а указательный палец прижатым к боковой стороне металлического стержня иглы возле кончика для контроля. С помощью мягкого, но сильного надавливания введите иглу быстрыми чередующимися пронационирующими супинирующими движениями через обезболенную кожу к подвздошному отделу позвоночника. Когда игла соприкоснется с задним подвздошным отделом позвоночника, снимите стилет и приложите к игле пустой шприц объемом 10 миллилитров.

Осторожно выведите поршень, чтобы создать отрицательное давление внутри шприца, пока не будет собрано до 10 миллилитров спикул костного мозга. Не принимайте более 10 мил костного мозга на аспират, чтобы избежать гемодилюции. Извлеките шприц и поместите стилет обратно на иглу.

Затем вылейте около двух миллилитров костного мозга в стекло часов и убедитесь, что взято достаточно образца для введения в покрытую гепарином восьмимиллилитровую трубку, и немедленно переверните трубку. Чтобы предотвратить свертывание крови, важно ввести пробирку, содержащую антикоагулянт, сразу после добавления костного мозга. Для оптимальной морфологической оценки с помощью пластикового шпателя перенесите спикулы из аспирата в стекле часов на предметное стекло и осторожно проведите еще одним предметным стеклом по верхней части костного мозга.

После высыхания окрашиваем спикулы препаратом May-Grunwald Giemsa для анализа методом световой микроскопии. Поместите трубку для костного мозга в пластиковый держатель и поместите держатель в пластиковый контейнер с асептической гелевой упаковкой и заполненной формой запроса. Перед анализом костного мозга с помощью проточной цитометрии запустите проточный цитометр и откройте программное обеспечение для анализа проточной цитометрии, чтобы создать новый эксперимент с точечной диаграммой прямого рассеяния и бокового рассеяния.

Для оценки размера и зернистости клеток загрузите немеченые лизированные клетки периферической крови от здорового донора и выберите функцию «Получить клетки». Задвижите лимфоциты и отрегулируйте напряжение прямого и бокового рассеяния для достижения соответствующих средних целевых значений для популяции стробированных клеток. Затем соберите данные по крайней мере для 10 000 событий.

Чтобы настроить напряжение фотоумножителя в целевом канале флуоресценции, сначала используйте калибровочные частицы с восемью пиками радужных шариков в соответствии с инструкциями производителя, чтобы получить 10 000 событий при низкой скорости потока. Затворите синглетные бусины на фронтальной и боковой точечной диаграмме с последующим стробированием 7-го пика на точечной диаграмме FITC-PE. Затворите результирующие популяции шариков для каждого флуорофора.

Продолжайте сбор данных о восьмипиковой радужной суспензии и отрегулируйте и точно настройте напряжение ФЭУ во всех флуоресцентных каналах для достижения целевых значений MFI в соответствии с инструкциями производителя. Используйте инструмент Запись для сбора данных примерно о 2 000 событий и проверьте MFI для 7-го пикового бусин. Далее добавьте достаточное количество каждого экспериментального конъюгированного антитела с флуорохромом, чтобы окрасить бусины в соответствующих флуоресцентных пробирках за вычетом одного контроля и тщательно обработать пробирки.

Создайте новый эксперимент с заготовкой с теми же параметрами компенсации, следя за тем, чтобы порог прямого рассеяния был установлен на 5 000, а значения компенсации для всех флурохрома равны нулю. Чтобы создать элементы управления компенсацией, выберите функцию «Создать управление компенсацией» и загрузите неокрашенную контрольную трубку. Отрегулируйте вентиль P1 вокруг популяции синглетных бусин и убедитесь, что вентиль P1 содержит только синглетные бусины.

Щелкните правой кнопкой мыши стрип P1 и выберите «Применить ко всем элементам управления компенсацией». Затем запишите данные для всех одиночных меченых флоресцентных трубок, подтверждающие, что P2-вентиль охватывает положительную популяцию на каждой гистограмме флуоресценции. Чтобы окрашивать клетки для проточного цитометрического анализа, транспортируйте костный мозг в лабораторию, проверьте форму запроса, чтобы проверить номер исследования пациента и дату рождения и определить, что необходимо окрашивать.

Для MRD мы используем окрашивающую панель, состоящую из четырех трубок. Здесь мы демонстрируем окрашивание панели LSC, которая состоит из одной трубки. После подсчета клеток переведите соответствующий объем костного мозга в новую 15-миллилитровую трубку.

Добавьте буфер для лизиса в 10 раз больше объема экспериментальной клетки, чтобы лизировать эритроциты. Переверните трубку, перемешайте и инкубируйте клетки в течение 10 минут при комнатной температуре. По окончании периода лизиса гранулируйте клетки методом центрифугирования.

Повторно суспендируйте клетки в 15 миллилитрах промывочного буфера при комнатной температуре и снова соберите клеточную гранулу путем центрифугирования. Тем временем нанесите пипеткой соответствующее количество раствора коктейля антител в пятимиллилитровые пробирки FACS. Здесь показана панель для пробирки со стволовыми клетками.

Повторно суспендируйте гранулу в промывочный буфер и добавьте клеточную суспензию в пробирку FACS, содержащую раствор коктейля моноклональных антител, для 15-минутной инкубации в темноте. Затем промойте ячейки в буфере для промывки и гранулируйте клетки центрифугированием. После центрифугирования суспендируйте гранулу в 400 микролитрах свежего буфера для промывки.

Чтобы проанализировать лейкозные стволовые клетки, добавьте четыре микролитра холостых шариков в клеточную суспензию, окрашенную коктейлем антител к стволовым клеткам. Затем считайте образцы с использованием ранее заданных параметров, получив не менее четырех раз по 10 до 6-го события из экспериментальных образцов пациентов. Для идентификации связанного с лейкемией иммунофенотипа, наблюдаемого примерно у 90% пациентов с острым миелоидным лейкозом, крайне важно, чтобы бластные ворота были установлены соответствующим образом, как показано на рисунке.

Здесь приведены примеры данных отдельных пациентов с различными типами аберрантии на CD34-положительных примитивных клетках. На этих графиках можно наблюдать пациента, который остается в полной ремиссии, и пациента, у которого произошел рецидив после получения измеримых положительных результатов остаточного заболевания после второго цикла индукционной терапии, что подчеркивает необходимость точной настройки ворот перед анализом образца. Идентификация и количественная оценка LSC требует дополнительного анализа аберрансий, конкретно на CD34-положительных CD38-отрицательных бластных клетках, как показано на этих графиках.

При выполнении этого протокола очень важно иметь специализированный и резервный персонал для забора образцов костного мозга, транспортировки, экспериментальной работы и этапов анализа этой процедуры. Эта процедура также может быть использована для проведения цитогенетического и молекулярного анализа для ответа на дополнительные вопросы о корреляции между конкретными клеточными популяциями и молекулярными аберранциями, представляющими интерес, или для уточнения группы риска пациента для прогнозирования клинического исхода. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области гематологии к изучению остаточных заболеваний у пациентов с ОМЛ после лечения.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как мы точно идентифицируем и количественно оцениваем остаточную болезнь с помощью проточной цитометрии, включая сбор и транспортировку образцов костного мозга пациентов с ОМЛ.