Метод для определения и моделирования проницаемости и распространения в ткань 3D модели в мембрану вставить системы для нескольких хорошо пластин

Общая цель этого протокола заключается в определении коэффициентов проницаемости и диффузии 3D-моделей кожи в небольшой системе мембранных вставок. Эти вопросы могут помочь ответить на ключевые вопросы о 3D-инженерии тканей кожи для фармацевтического и косметического применения, в которых проницаемость и коэффициент диффузии являются важными факторами качества. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет напрямую измерять эти коэффициенты в небольшой многолуночной всадке.

Маленькая система мембранных вставок в моделировании может быть дополнительно модифицирована для использования в устройствах на судах и в других приложениях, где используются системы мембранных вставок. Чтобы приготовить агарозный гель, начните с нанесения 28,6 микролитров свежеприготовленного жидкого агарозного геля с температурой 80 градусов Цельсия на каждую мембрану 96-луночной мембранной системы. Через 10 минут гель затвердеет и его можно будет использовать для анализа проницаемости.

Чтобы приготовить модель коллагеновой клетки, сначала смешайте на льду 125 микролитров HBSS и один миллилитр раствора коллагена R с последующей нейтрализацией гидроксидом натрия. Далее добавьте в смесь 125 микролитров первичных фибробластов, взвешенных в полной среде. И добавить по 28,6 микролитров полученного клеточного раствора в каждую лунку новой 96-луночной мембранной системы.

После 30 минут в инкубаторе для клеточных культур добавьте 75 микролитров полной среды на поверхность геля и 300 микролитров полной среды на дно каждой лунки для ночной инкубации в инкубаторе для клеточных культур. На следующий день замените среду 75 микролитрами высокотемпературных кератиноцитов с низким содержанием кальция для каждой модели коллагеновых клеток и верните планшет в инкубатор для клеточных культур еще на три дня. На четвертый день отсасывайте среду от поверхности модели клетки и верните планшет в инкубатор еще на семь дней.

Чтобы провести анализ проницаемости, дозируйте 75 микролитров донорского вещества в интересующую вас систему с небольшой вставкой и добавьте 300 микролитров акцепторного вещества на дно каждой лунки. Поместите планшет на шейкер при температуре 37 градусов Цельсия, влажности 95 процентов и примерно 480 оборотах в минуту в течение пяти часов, перенося систему мембранных вставок один раз в час в пустой 96-луночный планшет и измеряя диффузионную флуоресценцию в нижних лунках экспериментального планшета на считывателе планшетов. По окончании эксперимента по изучению проницаемости откройте соответствующее программное обеспечение для моделирования и начните новую модель.

Выберите Мастер моделей и 3D-модель. Добавьте Транспорт разбавленных веществ и нажмите Исследовать. Затем выберите «Зависит от времени» и нажмите «Готово».

В разделе «Глобальные определения» щелкните правой кнопкой мыши, чтобы добавить параметры, и введите геометрические и физические параметры в сетку. Настройте геометрию системы мембранных вставок из экспериментов и щелкните правой кнопкой мыши по Definitions, чтобы добавить два зонда домена, выбрав один зонд в качестве акцепторного домена, а другой — в качестве донорского. Установите оба домена в среднее значение с выражением C и единицей моль на метр в кубе.

И задайте коэффициент диффузии по свойствам транспорта one и переносу разбавленных веществ. Щелкните правой кнопкой мыши по транспорту разбавленных веществ, чтобы добавить второе транспортное свойство два, и выберите второй барьер в выборе домена. При переносе разбавленных веществ для начальных значений 1 определите концентрацию равной нулю.

Щелкните правой кнопкой мыши по транспорту разбавленных веществ, чтобы добавить второе начальное значение два и выбрать донора в качестве третьего домена. Установите концентрацию в качестве начальной концентрации флуоресцентного донорского вещества. Щелкните правой кнопкой мыши по переносу разбавленных веществ, чтобы добавить симметрию единица, и выберите все поверхности выделенной границы, которые отражают всю геометрию.

Щелкните правой кнопкой мыши по сетке, чтобы добавить два свободных тетраэдра и установить второй барьер в качестве домена. Щелкните правой кнопкой мыши по свободному тетраэдральному, чтобы добавить размер предварительно определенной сетки к сверхтонкому. Во втором свободном тетраэдре установите акцептор и донор в качестве доменов, а предварительно определенную сетку в более тонкое значение.

Затем в первом исследовании нажмите кнопку «Вычислить», чтобы начать моделирование. Чтобы подогнать коэффициент диффузии к данным, полученным в результате диффузионной симуляции, откройте меню «Добавить экстрасенс» и выберите «Математика». Найдите оптимизацию и чувствительность.

Выберите оптимизацию и нажмите кнопку Добавить в компонент. Затем щелкните правой кнопкой мыши по определениям, чтобы добавить переменные, и вручную введите переменные из третьей таблицы. Затем в меню сопряжения компонентов щелкните правой кнопкой мыши по определениям, добавьте среднее, затем вручную добавьте акцептор в качестве имени оператора и выберите домен.

Экспортируйте экспериментальные данные в новый текстовый документ. Используйте точку с запятой, чтобы разделить данные на столбцы, и перенос строки, чтобы разделить данные на строки. Щелкните правой кнопкой мыши по оптимизации для добавления глобальной цели наименьших квадратов и прикрепите текстовый документ к экспериментальным данным.

Щелкните Цель глобального метода наименьших квадратов, чтобы определить первый столбец времени как первый столбец времени, а второй столбец — как столбец значения один. В столбце выражения значения введите переменную C. Щелкните правой кнопкой мыши по оптимизации для добавления глобальных управляющих переменных one. И объявите поиск подчеркивания D как переменную с начальным значением единицы, нижней границей нуля и верхней границей 1 000.

Щелкните правой кнопкой мыши на первом исследовании, чтобы добавить оптимизацию. И выберите SNOPT в качестве метода решателя оптимизации. Установите допуск оптимальности равным единице в степени минус восьми.

Затем установите коэффициент диффузии на барьере в D.Установите изучаемое время моделирования от нуля секунд до 22 000 секунд с интервалом 100 секунд и нажмите кнопку Вычислить, чтобы начать оптимизацию параметров. Гистологический анализ модели коллагеновых клеток выявляет незначительное окрашивание фибробластов в пределах центрального матрикса. В верхней части коллагенового матрикса можно наблюдать слой, содержащий множество ядер, вероятно, состоящих из высокотемпературных кератиноцитов взрослого человека с низким содержанием кальция.

Использование флуоресцеина натриевой соли и флуоресцеина изотиоцианата декстрана для проверки влияния молекулярного размера диффундирующего вещества показывает, что для малых молекулярных размеров моделирование и экспериментальные данные хорошо согласуются для обеих молекул. Однако большие размеры молекул приводят к более высоким отклонениям в прогрессии кривой в симуляциях, демонстрируя задержку в начале и более сильный рост в более позднем ходе графиков. Действительно, коэффициент проницаемости уменьшается по мере увеличения размера молекул, при этом моделируемые коэффициенты ведут себя аналогично экспериментальным коэффициентам проницаемости.

Следует отметить, что большинство моделей, в которых используются высокотемпературные кератиноциты с низким содержанием кальция у взрослого человека, имеют более низкие коэффициенты проникновения и диффузии по сравнению с моделями без высокотемпературных кератиноцитов с низким содержанием кальция у взрослого человека. Модель коллагеновой симуляции может быть создана за 11-12 дней, а измерение проникания может быть завершено за шесть часов, если оно выполнено правильно. При выполнении процедуры важно поддерживать постоянные граничные условия, такие как температура, объем заполнения, концентрация наносимого вещества, влажность и мембранный процесс, чтобы уменьшить изменение коэффициента проникновения.

С помощью этого модуля моделирования можно сократить затраты на эксперимент и спрогнозировать долгосрочную производительность. Он также может быть адаптирован к другим проникающим устройствам или системам владения органами. Этот метод открывает путь для исследователей в области фармацевтического и косметического применения, а также взаимодействующих разработок в области тканевой инженерии для изучения процессов диффузионного проникновения в искусственные ткани.