Внедрение системы инфекционного проницаемой мембраны Вставка на основе для изучения влияния секретируемых бактериальными токсинами на млекопитающих клеток-хозяев

Общая цель этой системы на основе проницаемых мембранных вставок для лечения инфекций заключается в изучении воздействия секретируемых бактериальных токсинов на клетки хозяина во время инфекции. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области взаимодействия хозяина и патогена, например, как специфические секретируемые бактериальные компоненты участвуют в реакциях клеток хозяина во время бактериальной инфекции. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет изучать компоненты секретируемых бактерий и более точно моделирует физиологически значимую среду хозяин-патоген в контексте инфицирования человека.

Демонстрировать процедуру будет Ребекка Флаэрти, старший аспирант моей лаборатории. Чтобы получить изогенный стрептококк дикого типа группы А, или GAS, и мутантные штаммы GAS M1T1 5448, начните ночные жидкие культуры, вводя от 5 до 10 миллилитров бульона Тодда Хьюитта и инкубируя при 37 градусах Цельсия в течение 16 часов. Центрифугируйте ночные бактериальные культуры и используйте исходный объем свежей бактериальной среды для повторного суспендирования гранул.

Затем нормализуйте бактериальные культуры до равных исходных концентраций, разбавляя повторно суспендированные культуры в дополнительной среде до получения того же OD600. Для сбора лизатов для проведения анализа сигналов и анализа определения АТФ тарелируйте клетки HaCaT в шестилуночных чашках с плотностью посадки примерно от трех до 10 до пятой клетки на лунку и культивируют до 90% конфлюенции. Для проведения анализа мембранной пермеабилизации гомодимера этидия и высвобождения лактатдегидрогеназы клетки HaCaT помещают в 24-луночные чашки с плотностью посадки примерно от пяти до 10-40 клеток на лунку и увеличивают до 90% конфлюенции.

Непосредственно перед лечением используйте 1x PBS для промывания клеток. Затем на шестилуночные планшеты вносят два миллилитра свежей питательной среды с фармакологической обработкой или без нее, или 0,5 миллилитра среды в лунки 24-луночных планшетов. Затем под ламинарным колпаком с помощью стерильных щипцов осторожно поместите в каждую лунку стерильную проницаемую мембранную вставку размером 0,4 микрона.

Бережное и стерильное обращение с проницаемыми вставками во время подготовки к инфекции имеет решающее значение для предотвращения повреждения или загрязнения мембраны во время этого процесса. Нанесите свежую среду для клеточных культур в верхнюю камеру каждой лунки в соответствии с инструкцией производителя. Затем нанесите соответствующий объем нормализованных бактериальных культур на верхнюю камеру системы проницаемых мембранных вставок и нанесите бактериальную среду в контрольные лунки.

Осторожное добавление бактерий в верхнюю камеру, а также бережная транспортировка инфицированных клеток в инкубатор имеют решающее значение, поскольку важно, чтобы бактерии не загрязнили нижнюю камеру во время экспериментальной установки. Чтобы оценить секретируемые белки хозяина, используйте стерильные щипцы для осторожного удаления проницаемой мембранной вставки. Затем, не нарушая монослой клеток, соберите среду из нижней камеры в 1,5-миллилитровые пробирки.

Центрифугируйте образцы при температуре 14 000 RCF и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут, чтобы измельчить клеточный мусор. Затем удалите все, кроме 50 микролитров надосадочной жидкости, переложите в свежую 1,5-миллилитровую пробирку и храните при температуре минус 20 градусов по Цельсию или используйте немедленно. Для оценки лизатов клеток-хозяев осторожно аспирируйте среду над монослоем, не нарушая клетки-хозяева.

Затем используйте PBS для промывки клеток один раз. Осторожно аспирируйте PBS и немедленно нанесите объем ледяного буфера для лизиса, чтобы достичь, например, концентрацию белка от 0,5 до 1,5 миллиграмма на миллилитр. Затем инкубируйте образцы на льду в течение 15 минут.

Затем с помощью скребка для клеток отсоедините клетки от поверхности пластины каждой лунки и перенесите все содержимое каждой лунки в 1,5-миллилитровую трубку. Затем центрифугируйте образцы при температуре 14 000 RCF и четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. Чтобы оценить содержание растворимых компонентов листата, перенесите надосадочную жидкость в свежую пробирку и храните при температуре минус 20 градусов Цельсия или используйте немедленно.

Для оценки ядерных или других нерастворимых лизатных компонентов зарезервируйте гранулу и храните при температуре минус 20 градусов Цельсия или используйте немедленно. Для оценки с помощью иммунофлуоресцентной визуализации аспирируйте среду и используйте 1x холодный PBS для промывания клеток. Затем, с помощью 4% PFA и PBS, зафиксируйте клетки на ночь.

Проведите дальнейшие анализы в соответствии с текстовым протоколом. Показанные здесь данные вестерн-блоттинга демонстрируют значительно повышенную активацию p38 MAP киназы и кератиноцитов в присутствии стрептолизина S или штаммов газа, продуцирующих SLS, что указывает на то, что эта система может быть использована для оценки изменений в активации контакт-независимых сигнальных белков хозяина. На этом рисунке показана SLS-зависимая активация ключевого медиатора воспаления ядерного фактора каппа B, который перемещается из цитоплазмы в ядро при активации, что указывает на то, что эта система может быть использована для визуализации влияния секретируемых бактериальных факторов на белковые ответы хозяина с помощью подходов иммунофлуоресцентной микроскопии.

Здесь продемонстрировано значительное увеличение как мембранной проницаемости, так и высвобождения LDH из клеток-хозяев после воздействия газовых штаммов, продуцирующих SLS, по сравнению с неинфицированными клетками или клетками, подвергшимися воздействию штамма с дефицитом SLS. Эти результаты указывают на то, что эта система может оценивать токсин-зависимые изменения цитотоксичности хозяина. В этом эксперименте определяли уровни АТФ в кератиноцитах и реакцию на газовую инфекцию.

16 часов после инфицирования наблюдалось значительное снижение АТФ, а потеря АТФ была более выраженной в присутствии SLS, что согласуется с токсин-зависимым увеличением сигнализации стрессовой реакции хозяина и токсичности. После того, как этот метод будет разработан, он может быть использован для изучения специфических реакций любого секретируемого микробного фактора на различных типах клеток-хозяев. При выполнении этой процедуры важно практиковать стерильную технику на всех этапах экспериментальной установки и соблюдать осторожность при обращении с проницаемыми мембранными вставками, как во время первоначальной настройки, так и во время сбора образцов.

После этой процедуры могут быть выполнены такие методы, как вестерн-блоттинг, иммунофлуоресцентная визуализация и анализ мембранной мембраны, чтобы определить, как бактериальный фактор, представляющий интерес, способствует изменениям в сигнальных каскадах и влияет на общую цитотоксичность во время инфекции. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как готовить образцы клеток-хозяев для оценки различных реакций клеток-хозяев после воздействия определенного секретируемого бактериального фактора, представляющего интерес. Не забывайте, что работа с биологически опасными материалами, такими как бактериальные патогены, требует определенных соображений безопасности.

Для безопасного проведения этих экспериментов необходимо надлежащее использование защитных очков, перчаток и лабораторных халатов, а также правильное использование капюшона биобезопасности.