Внедрение системы инфекционного проницаемой мембраны Вставка на основе для изучения влияния секретируемых бактериальными токсинами на млекопитающих клеток-хозяев

Общая цель данной системы инфицирования с использованием вставок с проницаемой мембраной заключается в изучении воздействия секретируемых бактериальных токсинов на клетки хозяина в процессе инфекции. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области взаимодействия хозяина и патогена, например, о том, как определенные секретируемые компоненты бактерий влияют на ответы клеток хозяина при бактериальной инфекции. Основным преимуществом данной методики является возможность изучения секретируемых компонентов бактерий и более точное моделирование физиологически релевантной среды взаимодействия хозяина и патогена в контексте инфекции человека.

Процедуру продемонстрирует Ребекка Флаэрти, аспирантка старшего курса моей лаборатории. Чтобы подготовить изогенные штаммы бета-гемолитического стрептококка группы A (Group A streptococcus, GAS) дикого типа и мутантные штаммы GAS M1T1 5448, создайте ночные жидкие культуры, инокулировав 5–10 мл бульона Тодда-Хьюитта и инкубируя их при 37 °C в течение 16 часов. Центрифугируйте ночные культуры бактерий и используйте исходный объем свежей бактериальной среды для ресуспендирования осадка.

Затем нормализуйте бактериальные культуры до одинаковых начальных концентраций, разбавляя ресуспендированные культуры дополнительной средой до достижения одинакового значения OD600. Для сбора лизатов с целью проведения анализа сигнальных путей и определения уровней АТФ высейте клетки HaCaT в шестилуночные планшеты с плотностью посева примерно 3 × 10⁵ клеток на лунку и культивируйте до достижения 90% конфлюэнтности. Для проведения анализа проницаемости мембран с помощью этидия гомодимера и анализа высвобождения лактатдегидрогеназы высейте клетки HaCaT в 24-луночные планшеты с плотностью посева примерно 5 × 10⁴ клеток на лунку и выращивайте до достижения 90% конфлюэнтности.

Непосредственно перед началом обработки промойте клетки 1x PBS. Затем добавьте в лунки шестилуночных планшетов два миллилитра свежей ростовой среды с фармакологическим препаратом или без него, либо 0,5 миллилитра среды в лунки 24-луночных планшетов. После этого, работая в ламинарном шкафу, с помощью стерильного пинцета осторожно поместите стерильную проницаемую мембранную вставку с порами 0,4 микрона в каждую лунку.

Бережное и стерильное обращение с проницаемыми вставками во время подготовки к инфицированию имеет решающее значение для предотвращения повреждения или загрязнения мембраны в ходе этого процесса. Добавьте свежую питательную среду для культур клеток в верхнюю камеру каждой лунки согласно инструкциям производителя. Затем внесите соответствующий объем нормализованных бактериальных культур в верхнюю камеру системы проницаемых мембранных вставок, а в контрольные лунки добавьте бактериальную среду.

Осторожное добавление бактерий в верхнюю камеру, а также бережная транспортировка инфицированных клеток в инкубатор имеют решающее значение, так как крайне важно, чтобы бактерии не попали в нижнюю камеру во время подготовки эксперимента. Для анализа секретируемых белков хозяина с помощью стерильного пинцета осторожно извлеките вставку с проницаемой мембраной. Затем, не нарушая целостности монослоя клеток, соберите среду из нижней камеры в пробирки объемом 1,5 мл.

Центрифугируйте образцы при 14 000 RCF и температуре 4 °C в течение 10 минут для осаждения клеточного дебриса. Затем удалите весь супернатант, кроме 50 µL, перенесите его в новую пробирку объемом 1,5 мл и храните при -20 °C или используйте немедленно. Для анализа лизатов клеток-хозяев осторожно аспирируйте среду над монослоем, не повреждая клетки-хозяева.

Затем один раз промойте клетки с помощью PBS. Осторожно аспирируйте PBS и немедленно добавьте объем ледяного лизирующего буфера, чтобы добиться, например, концентрации белка от 0,5 до 1,5 мг/мл. После этого инкубируйте образцы на льду в течение 15 минут.

Затем с помощью скребка для клеток отделите клетки от поверхности пластин в каждой лунке и перенесите всё содержимое каждой лунки в пробирку объемом 1,5 мл. После этого центрифугируйте образцы при 14 000 RCF и температуре 4 °C в течение 20 минут. Для анализа растворимых компонентов лизата перенесите супернатант в новую пробирку и храните при температуре -20 °C либо используйте сразу.

Для анализа ядерных или других нерастворимых компонентов лизата сохраните осадок и храните его при температуре -20 °C или используйте немедленно. Для анализа методом иммунофлуоресцентной визуализации удалите среду и промойте клетки холодным 1x PBS. Затем зафиксируйте клетки в 4% PFA и PBS в течение ночи.

Проведите дальнейший анализ в соответствии с текстовым протоколом. Данные вестерн-блоттинга, представленные здесь, демонстрируют значительное усиление активации p38 MAP-киназы в кератиноцитах в присутствии стрептолизина S или штаммов gas, продуцирующих SLS, что указывает на возможность использования данной системы для оценки изменений в активации контакт-независимых сигнальных белков хозяина. На этом рисунке показана SLS-зависимая активация ключевого воспалительного медиатора — ядерного фактора каппа B, который при активации перемещается из цитоплазмы в ядро; это свидетельствует о том, что данная система может быть использована для визуализации воздействия секретируемых бактериальных факторов на ответы белков хозяина с помощью методов иммунофлуоресцентной микроскопии.

Здесь продемонстрировано значительное усиление как мембранной пермеабилизации, так и высвобождения LDH из клеток-хозяев после воздействия штаммов gas, продуцирующих SLS, по сравнению с неинфицированными клетками или клетками, подвергшимися воздействию штамма с дефицитом SLS. Эти результаты указывают на то, что данная система позволяет оценивать зависимые от токсина изменения цитотоксичности хозяина. В этом эксперименте были определены уровни ATP в кератиноцитах и их ответ на инфекцию gas.

Через 16 часов после инфицирования наблюдалось значительное снижение уровня ATP, причем потеря ATP была более выраженной в присутствии SLS, что согласуется с токсин-зависимым усилением сигналинга стрессового ответа хозяина и токсичности. После освоения данный метод может быть использован для изучения специфических реакций любого секретируемого микробного фактора на различных типах клеток хозяина. При выполнении данной процедуры важно соблюдать правила стерильности на всех этапах подготовки эксперимента, а также осторожно обращаться с вставками с проницаемой мембраной как при первоначальной установке, так и во время сбора образцов.

После выполнения данной процедуры можно провести такие методы, как вестерн-блоттинг, иммунофлуоресцентная визуализация и анализы проницаемости мембран, чтобы определить, как интересующий бактериальный фактор способствует изменениям в сигнальных каскадах и влияет на общую цитотоксичность в ходе инфекции. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготавливать образцы клеток хозяина для оценки различных клеточных ответов после воздействия конкретного секретируемого бактериального фактора. Не забывайте, что работа с биоопасными материалами, такими как бактериальные патогены, требует соблюдения определенных мер безопасности.

Для безопасного проведения данных экспериментов необходимо использовать защитные очки, перчатки и лабораторные халаты, а также правильно эксплуатировать бокс биологической безопасности.