Мультиплекс цитокина профилирование Splenocytes стимулировали мыши с использованием платформы на базе гранулярных шарик иммуноанализа

Общая цель этого протокола заключается в количественном определении нескольких цитокиновых мишеней одновременно в надосадочной жидкости тканевых культур, собранных из стимулированных спленоцитов мышей с использованием мультиплексного иммунологического анализа на основе гранул и проточного цитометра. Этот метод может быть использован для ответа на ключевые вопросы в области иммунологии, такие как: каковы уникальные цитокиновые профили, которые управляют иммунным ответом в контексте конкретных состояний заболевания? Основное преимущество этого метода заключается в том, что одновременное количественное определение нескольких кольчатых червей может быть выполнено с использованием гораздо меньших объемов образцов по сравнению с традиционными форматами ИФА, в то же время уменьшая неспецифическое связывание.

Демонстрировать процедуру будет Николас Джонсен (Nicholas Johnsen), научный сотрудник нашей группы разработчиков продуктов. Начните эту процедуру с подготовки биологического образца, как описано в текстовом протоколе. Для приготовления предварительно смешанных гранул, иммобилизованных антителами, произведите ультразвуковую обработку флакона с предварительно смешанными гранулами в течение одной минуты в ванне с ультразвуком при комнатной температуре.

Затем сделайте вихрь в течение 30 секунд перед использованием. Если ванна с ультразвуковой аппаратурой недоступна, увеличьте время вихря до одной минуты. Для стандартного приготовления добавьте 250 микролитров буфера для анализа, чтобы восстановить лиофилизированный стандартный коктейль Mouse Th Cytokine.

Перемешайте, кратко перемешав, и дайте флакону постоять при комнатной температуре в течение 10 минут. Переложите стандартный коктейль в полипропиленовую микроцентрифужную пробирку с маркировкой С7. Это будет использоваться в качестве высшего стандарта. Промаркируйте шесть полипропиленовых микроцентрифужных пробирок в категориях от C1 до C6. Добавьте в каждую из этих пробирок по 75 микролитров буфера для анализа.

Затем перелейте 25 микролитров высшего стандарта, C7, в пробирку C6 и хорошо перемешайте путем вортексинга. Это будет стандарт С6. Продолжайте выполнять последовательное разведение от одного до четырех разведений, используя новый наконечник для пипетки для каждой пробирки, чтобы добавить 25 микролитров предыдущего стандарта к 75 микролитрам буфера для анализа в следующей пробирке с самым низким стандартом.

Следите за каждым сложением с помощью вортекса. Используйте буфер для анализа в качестве нулевого стандарта пикограмм на миллилитр. Для проведения анализа перед применением дайте всем реагентам нагреться до комнатной температуры.

В этой демонстрации используются полипропиленовые фильтрующие пластины. Крайне важно, чтобы пластина оставалась в вертикальном положении на протяжении всей процедуры анализа, включая этапы промывки, чтобы избежать потери бусин. Предварительно намочите фильтровальную бумагу, добавив 100 микролитров буфера для промывки 1X в каждую лунку, и дайте пластинам постоять одну минуту при комнатной температуре.

Удалите буферный объем с помощью вакуумного коллектора. Промокните излишки буфера для стирки с нижней части тарелки, прижав пластину к стопке чистых бумажных полотенец. Затем поместите тарелку поверх перевернутой крышки тарелки.

Для образцов надосадочной жидкости для клеточных культур добавьте во все лунки по 25 микролитров буфера для анализа. Добавьте по 25 микролитров каждого стандарта в стандартные лунки. Наконец, добавьте по 25 микролитров каждого образца в лунки для образцов.

Перемешайте бусины в течение 30 секунд. Затем добавьте по 25 микролитров смешанных шариков в каждую лунку, периодически встряхивая бусину, чтобы избежать оседания бусин. Запечатайте пластину с помощью пломбировщика.

После запечатывания оберните всю пластину, включая перевернутую крышку пластины, алюминиевой фольгой. Поместите тарелку на шейкер для тарелок, закрепите ее и встряхивайте со скоростью примерно 500 об/мин в течение двух часов при комнатной температуре. Не переворачивая, поместите пластину на вакуумный коллектор и подайте вакуум, как и раньше.

Затем добавьте в каждую лунку по 200 микролитров буфера для промывки 1X. Удалите содержимое лунок с пробирной пластины методом вакуумной фильтрации. Промокните излишки буфера для стирки с нижней части тарелки впитывающей салфеткой или бумажными полотенцами, прежде чем повторить этот шаг еще раз.

Далее добавьте в каждую лунку по 25 микролитров антител для обнаружения. После герметизации пластины свежим запайщиком оберните всю пластину, включая перевернутую крышку пластины, алюминиевой фольгой. Поместите тарелку на шейкер для тарелок и встряхивайте со скоростью примерно 500 об/мин в течение одного часа при комнатной температуре.

Не вакуумируя, добавьте по 25 микролитров реактива стрептавидина фикоэритрина непосредственно в каждую лунку. Запечатайте и оберните тарелку, как и раньше. Затем поместите тарелку на шейкер для тарелок и встряхивайте со скоростью примерно 500 об/мин в течение 30 минут при комнатной температуре.

Повторив этап вакуумной фильтрации дважды, добавьте в каждую лунку по 200 микролитров промывочного буфера 1X. Снова подвесьте бусины на шейкере для тарелок на одну минуту. С помощью многоканальной пипетки перенесите образцы с фильтрующей пластины в пробирки FACS для считывания образцов на проточном цитометре.

Запустите проточный цитометр и программное обеспечение для сбора данных в соответствии с инструкциями производителя, прилагаемыми к прибору. Создайте точечную диаграмму с прямым разбросом по оси X и боковым разбросом по оси Y. Установите прямой разброс и боковой разброс в линейный режим.

Сделайте вихревой пузырек с необработанными бусинами, входящими в комплект, на 30 секунд для повторного подвешивания бусин. Переложите 400 микролитров сырых шариков в новую пробирку FACS. Установите низкую скорость потока проточного цитометра.

Запустите необработанные бусины, тщательно регулируя усиление и напряжение для прямого и бокового рассеяния так, чтобы оба размера этих бусин были заметно разделены и их было легко забить. Отрегулируйте порог прямого рассеивания, чтобы исключить нежелательные события. На диаграмме прямого рассеяния и бокового рассеяния нарисуйте вентиль, включающий все популяции бусин.

Отобразите популяции стробируемых швов от прямой и боковой диаграммы рассеяния на второй точечной диаграмме с PE по оси X и APC по оси Y. Отрегулируйте напряжение ФЭУ для флуоресцентного канала APC таким образом, чтобы сигнал APC для всех популяций шариков имел медианную интенсивность флуоресценции, или MFI, в диапазоне от 10 до 5 000. Затем переведите флакон с установочными бусинами из полиэтилена на 30 секунд, чтобы снова подвесить бусины.

Переложите 400 микролитров повторно суспензированных полиэтиленовых шариков в новую трубку FACS. Замените трубку с необработанными шариками в проточном цитометре на трубку из полиэтиленовых шариков. Отрегулируйте напряжение фотоумножителя для настройки флуоресцентного канала ПЭ таким образом, чтобы MFI гранул из полиэтилена находился в пределах диапазона для конкретной партии, указанного на флаконе с шариками из полиэтилена.

Чтобы выполнить сбор данных, установите количество событий со швами, которое должно быть собрано, равным примерно 300 для каждого анолита. Сделайте вихревой анализ каждого образца в течение пяти секунд перед анализом. Затем ознакомьтесь с образцами.

При считывании образцов сначала установите проточный цитометр в режим настройки и подождите, пока популяция шариков стабилизируется, прежде чем переключаться в режим сбора. Экспортируйте только закрытые события, а не общее количество событий, прежде чем выполнять анализ данных, как описано в текстовом протоколе. Репрезентативные стандартные кривые для целевых анолитов были построены с использованием Т-хелперной цитокиновой панели мыши.

Правильно проведенные анализы продемонстрируют кривые с широкими динамическими диапазонами, как показано здесь. Стандартные кривые должны запускаться каждый раз при проведении анализа. Спленоциты мышей культивировали в различных условиях в течение 48 часов.

Были собраны супернатанты культур, а затем количественно определены концентрации 13 мишеней с помощью Т-хелперной цитокиновой панели мыши. Четко видны профили дифференциальной экспрессии цитокинов в ответ на условия стимуляции. После освоения лабораторный стенд этой техники может быть завершен менее чем за пять с половиной часов при правильном выполнении.

Время сбора данных и последующего анализа будет варьироваться в зависимости от количества образцов. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как использовать этот протокол, количественно определять концентрацию анолита в биологических образцах с помощью цитометрического иммуноанализа, основанного на гранулах. Это включает в себя подготовку реагентов, этапы инкубации и настройку проточного цитометра для сбора данных.