Экспрессия генов профилирования заражения микробами, использующим платформу цифровой штрих-кодирования

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы точно измерить экспрессию генов патогена in vivo, чтобы пролить свет на то, как патоген адаптируется к инфекционной среде и наносит ущерб своему хозяину. Этот метод проложил путь исследователям в области инфекционных заболеваний к изучению динамики экспрессии генов патогена во время реальной инфекции на различных типах тканей и в различных временных точках. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обладает высокой чувствительностью и чрезвычайной воспроизводимостью.

Этот метод позволяет количественно оценить экспрессию генов патогена в небольшом количестве тканей от реальной инфекции. Чтобы начать приготовление реагентов, добавьте 2-меркаптоэтанол в буфер RLT и хорошо перемешайте. Приготовьте смесь раствора фенола-хлороформа изоамилового спирта в соотношении 25:24:1.

Пробирки для гомогенизации типа М маркируют и охлаждают на льду. Наклейте этикетку на две пробирки с завинчивающейся крышкой миллилитров и добавьте примерно 300 микролитров шариков диоксида циркония в каждую пробирку. Подготовьте к использованию следующие инструменты, в том числе тканевый диссоциатор, взбиватель для шариков, настольную центрифугу с адаптерами для пробирок на 50 миллилитров и планшеты на 96 лунок и фотометр.

Извлеките из морозильной камеры при температуре 80 градусов Цельсия ранее замороженные почки, выделенные у мышей, инфицированных C.albicans, и положите их на лед. Добавьте по 1,2 миллилитра буферного RLT в каждую почку. Затем сцедите каждую почку с буфером в гомогенизационную трубку М-типа.

Количество используемого буфера RLT определено опытным путем. Слишком большое количество буферного RLT приведет к разбавлению концентрации образца, в то время как слишком малое количество сделает гомогенат очень вязким и чрезвычайно сложным в обращении. Далее, используя тканевый диссоциатор на предварительно загруженной РНК 2.01, гомогенизируйте почки.

Затем центрифугируйте при 1000 x G в течение одной минуты. Перелейте по 600 микролитров каждого гомогената в пробирку с завинчивающейся крышкой, содержащую шарики диоксида циркония, и сохраните оставшийся гомогенат на льду. Добавьте в каждую пробирку по 600 микролитров фенол-хлороформного изоамилового спирта, плотно закройте крышками и вихревите на венчике бусины в течение трех минут при четырех градусах Цельсия.

Центрифугируйте при 15 000 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Осторожно переложите водную фазу в новую микрофужную пробирку объемом 1,5 миллилитров, добавив равный объем 70% этанола. Затем загрузите на спиновую колонну и вращайте при 8 000 x G. С помощью 700 микролитров буферной RW промойте каждую спиновую колонку один раз, а затем две промывки 500 микролитрами буферного RPE.

Переложите колонки в сухие сборные пробирки и поверните еще одну минуту, чтобы удалить остатки жидкости. Наконец, используйте 50 микролитров воды для элюирования РНК. Затем с помощью спектрофотометра с наружным диаметром 216 анимеров измерьте концентрацию РНК.

Чтобы выполнить профилирование экспрессии генов с помощью цифрового штрих-кодирования, начните с размораживания набора кодов репортера и набора кодов захвата на льду. Добавьте 130 микролитров буфера гибридизации в набор кодов репортера. Переверните для перемешивания и уменьшите вращение.

Далее добавьте по 20 микролитров смеси в каждую из 12 реакционных пробирок. Затем добавьте 10 мкг общей тканевой РНК в каждую пробирку и перемешайте с помощью пипетирования. В зависимости от модели инфекции, размера инокулюма и используемого штамма патогена, процентное содержание РНК патогена в общем объеме РНК варьируется от 0 до 2%. Поэтому общее количество РНК, которое необходимо добавить для каждого из них, должно быть оптимизировано эмпирически.

Теперь добавьте пять микролитров набора кода захвата в каждую пробирку. Перемешивайте, переворачивая трубки, и быстро вращайте вниз. Затем инкубируйте реакции в термоамплификаторе при температуре 65 градусов Цельсия с нагретой крышкой в течение примерно 18 часов.

Извлеките один картридж с образцом от 20 градусов Цельсия и дайте ему нагреться до комнатной температуры. Снимите две пластины с реагентами при температуре четыре градуса Цельсия и вращайте в настольной центрифуге при температуре 670 x G в течение двух минут. Далее настройте станцию подготовки, следуя пошаговым инструкциям на экране, выбрав вариант с высокой чувствительностью.

Затем снимите реакции с термоамплификатора и немедленно загрузите на подготовительную станцию. После запуска трехчасовой программы высокой чувствительности извлеките картридж и заклейте дорожки прозрачной лентой с помощью прозрачной ленты. При необходимости нанесите минеральное масло на дно картриджа.

Затем загрузите картридж в цифровой анализатор. Настройте цифровой анализатор, следуя пошаговым инструкциям на экране, выбрав вариант сканирования с высоким разрешением. После запуска программы сканирования загрузите результаты или выберите получение их по электронной почте и импортируйте необработанные данные в программное обеспечение производителя.

Анализируйте данные в соответствии с текстовым протоколом. Протокол, продемонстрированный в этом видео, имеет уникальное преимущество в том, что он использует как зонд захвата, так и зонд отчета для повышения специфичности и уменьшения шума от РНК хозяина. Как показано здесь, все исходные исходные данные из неинфицированного образца ткани были ниже 10, в то время как исходные данные из двух инфицированных образцов тканей были выше 10.

Исходные подсчеты из двух биологических образцов показали очень хорошую корреляцию со значением R в квадрате 0,945. Платформа также обеспечивает достаточный динамический диапазон, чтобы охватить естественные уровни биологической экспрессии. С помощью набора зондов, определяющего 248 генов реакции окружающей среды, были определены две фазы экспрессии генов патогена.

Ранняя реакция экспрессии генов включает гены с уровнями РНК, значительно различающимися между образцами посева и образцами через 12 часов после заражения. Также была обнаружена поздняя реакция экспрессии генов, которая включает гены с уровнями РНК, которые значительно различаются между образцами в 12-часовую точку и через 48 часов после заражения. Эти результаты указывают на то, что экспрессия гена C.albicans динамически регулируется во время инвазивной инфекции млекопитающего-хозяина.

Этот способ прост и быстр. Вся процедура от сбора тканей до сдачи данных занимает менее 48 часов. Время работы составляет около четырех часов для 12 образцов.

Хотя этот метод разработан для фиксации экспрессии генов патогена in vivo, он также может быть использован для ответа на экспрессию генов хозяина. Таким образом, исследователи могут получить полезную информацию с обеих сторон инфекции одновременно.