Экспрессия генов профилирования заражения микробами, использующим платформу цифровой штрих-кодирования

Общая цель данного эксперимента — точно измерить экспрессию генов патогена in vivo, чтобы прояснить, как патоген адаптируется к инфекционной среде и наносит повреждения организму хозяина. Этот метод открыл исследователям в области инфекционных заболеваний возможность изучать динамику экспрессии генов патогена в условиях реальной инфекции в различных типах тканей и в разные моменты времени. Основным преимуществом данного метода является его высокая чувствительность и исключительная воспроизводимость.

Данный метод позволяет количественно определить экспрессию генов патогена в минимальном количестве тканей, полученных при реальной инфекции. Для начала подготовки реагентов добавьте 2-меркаптоэтанол в буфер RLT и тщательно перемешайте. Приготовьте смесь раствора фенол-хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 25:24:1.

Промаркируйте гомогенизационные пробирки типа M и охладите их на льду. Промаркируйте пробирки с завинчивающимися крышками объемом два миллилитра и добавьте в каждую примерно 300 µL циркониевых шариков. Подготовьте к работе следующие приборы: диссоциатор тканей, гомогенизатор с шариками (bead beater), настольную центрифугу с адаптерами для пробирок объемом 50 мл и 96-луночных планшетов, а также фотометр.

Извлеките ранее замороженные почки, выделенные из мышей, инфицированных C.albicans, из морозильной камеры при температуре 80 °C и поместите их на лед. Добавьте 1,2 мл буфера RLT в каждую почку. Затем перенесите каждую почку вместе с буфером в гомогенизационную трубку типа M.

Количество используемого буфера RLT определяется эмпирическим путем. Избыток буфера RLT приведет к разбавлению образца, в то время как его недостаточное количество сделает гомогенат слишком вязким, что крайне затруднит дальнейшую работу. Затем гомогенизируйте почки с помощью гомогенизатора тканей, используя предустановленный режим RNA 2.01.

Затем центрифугируйте при 1000 x G в течение одной минуты. Перенесите 600 µL каждого гомогената в пробирку с завинчивающейся крышкой, содержащую циркониевые шарики, а оставшийся гомогенат храните на льду. Добавьте в каждую пробирку 600 µL смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт, плотно закройте крышки и подвергните перемешиванию на вортексе (бид-битере) в течение трех минут при 4 °C.

Центрифугируйте при 15 000 G в течение пяти минут при температуре four degrees celsius. Осторожно перенесите водную фазу в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 milliliter, добавив равный объем 70% ethanol. Затем нанесите образец на спин-колонку и центрифугируйте при 8 000 x G. Промойте каждую спин-колонку один раз, используя 700 microliters буфера RW, а затем дважды промойте 500 microliters буфера RPE.

Перенесите колонки в сухие пробирки для сбора и центрифугируйте еще одну минуту, чтобы удалить остатки жидкости. В конце используйте 50 µL воды для элюции РНК. Затем с помощью спектрофотометра при OD 216 нм измерьте концентрацию РНК.

Для проведения профилирования экспрессии генов с использованием цифрового штрихкодирования начните с размораживания набора репортерных кодов и набора кодов захвата на льду. Добавьте 130 µL гибридизационного буфера к набору репортерных кодов. Перемешайте путем инверсии и центрифугируйте для сбора содержимого на дно.

Затем добавьте по 20 µL смеси в каждую из 12 реакционных пробирок. После этого добавьте в каждую пробирку 10 µg суммарной РНК ткани и перемешайте путем пипетирования. В зависимости от модели инфекции, размера инокулята и используемого штамма патогена, процент РНК патогена в составе суммарной РНК варьирует от 0 до 2%. Таким образом, общее количество РНК, которое необходимо добавить в каждом случае, следует оптимизировать эмпирически.

Теперь добавьте по 5 µL набора кодов захвата в каждую пробирку. Перемешайте, переворачивая пробирки, и быстро центрифугируйте. Затем инкубируйте реакционные смеси в амплификаторе при 65 °C с подогревом крышки в течение приблизительно 18 часов.

Извлеките один картридж с образцом из температуры 20 °C и дайте ему нагреться до комнатной температуры. Извлеките две планшеты с реагентами из температуры 4 °C и центрифугируйте их в настольной центрифуге при 670 x G в течение двух минут. Затем подготовьте станцию подготовки, следуя пошаговым инструкциям на экране, выбрав вариант высокой чувствительности.

Затем извлеките реакционные смеси из амплификатора и немедленно поместите их на подготовительную станцию. После завершения трехчасовой программы повышенной чувствительности извлеките картридж и загерметизируйте дорожки прозрачной клейкой лентой. При необходимости нанесите минеральное масло на нижнюю часть картриджа.

Затем установите картридж в цифровой анализатор. Настройте цифровой анализатор, следуя пошаговым инструкциям на экране, выбрав опцию сканирования с высоким разрешением. После запуска программы сканирования загрузите результаты или выберите получение по электронной почте, а затем импортируйте необработанные данные в программное обеспечение производителя.

Проанализируйте данные в соответствии с текстовым протоколом. Протокол, продемонстрированный в данном видео, обладает уникальным преимуществом, так как в нем используются как захватывающий зонд, так и репортерный зонд для повышения специфичности и снижения уровня шума от РНК хозяина. Как показано здесь, фоновые необработанные значения (raw counts) в образце неинфицированной ткани были ниже 10, в то время как необработанные значения в двух образцах инфицированной ткани были выше 10.

Необработанные данные подсчета из двух биологических образцов продемонстрировали очень хорошую корреляцию со значением R² 0,945. Платформа также обеспечивает достаточный динамический диапазон для охвата естественных уровней биологической экспрессии. С использованием набора зондов, специфичных для 248 генов ответа на воздействие факторов окружающей среды, были определены две фазы экспрессии генов патогена.

Ранний ответ экспрессии генов включает гены, уровни РНК которых существенно различаются в образцах инокулята и образцах через 12 часов после заражения. Также был выявлен поздний ответ экспрессии генов, который включает гены с уровнями РНК, имеющими значительные различия между временными точками 12 и 48 часов после заражения. Эти результаты указывают на то, что экспрессия генов C.albicans динамически регулируется в процессе инвазивной инфекции организма млекопитающего.

Этот метод прост и быстр. Весь процесс от сбора тканей до представления данных занимает менее 48 часов. Время непосредственной работы составляет около четырех часов для 12 образцов.

Хотя данный метод был разработан для анализа экспрессии генов патогена in vivo, его также можно использовать для изучения экспрессии генов хозяина. Таким образом, исследователи могут одновременно получать полезную информацию о обеих сторонах инфекционного процесса.