Использование референтных реагентов для подтверждения надежности анализов высвобождения цитокинов для прогнозирования безопасности моноклональных антител

Тестирование безопасности новых лекарств имеет решающее значение, и этот протокол описывает, как использовать валидированные стандарты для оценки воспроизводимости, надежности и потенциальных ограничений платформы CRS. Этот метод был проверен с использованием этих реагентов в 11 различных лабораториях, а также в международном совместном исследовании с аналогичными паттернами реакции, что улучшило усилия по гармонизации и воспроизводимости. Применение этого метода направлено на улучшение тестирования риска СВК новых терапевтических антител, а также поможет быть готовым к клиническому лечению потенциальных побочных эффектов.

Эта работа направлена на улучшение воспроизводимости и гармонизации, а визуальная демонстрация повышает шансы на воспроизводимость. Начните с восстановления содержимого референтных ампул реагента в одном миллилитре стерильной дистиллированной воды и дайте возможность регидратации от 5 до 10 минут. Затем тщательно перемешайте каждый раствор антитела, прежде чем переложить его в стерильную пробирку с крышкой.

Затем разведите каждое восстановленное антитело и проверьте антитела до 10 микрограммов на миллилитр в стерильном PBS. Возьмите стерильный, не обработанный ТК полипропиленовый 96-луночный микротитровый планшет с U-образным дном и добавьте 100 микролитров желаемого раствора разбавленных антител в предназначенные для этого лунки планшета. Затем инкубируйте планшет в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия перед проведением твердофазного анализа.

Собрав минимум 30 миллилитров периферической цельной крови в гепаринизированную пробирку, переверните ее несколько раз, чтобы обеспечить правильное смешивание образца крови с гепарином натрия. Отложите 15 миллилитров образца цельной крови в отдельную пробирку для использования в последующей водной фазе анализа цельной крови. Разбавьте оставшиеся 15 миллилитров цельной крови, добавив равный объем либо PBS, либо несывороточной среды RPMI 1640.

Аккуратно выложите разведенную кровь сверху на 15 миллилитров градиентной среды плотности в 50-миллилитровой пробирке. Центрифугируйте пробирку с помощью поворотно-откидного ротора без тормоза и с пониженным ускорением при 500 G и комнатной температуре в течение 20 минут, чтобы разделить кровь на различные компоненты. После центрифугирования градиент плотности отделяется в виде верхнего слоя плазмы, за которым следует тонкий слой охристого покрытия, содержащий PBMC, и нижний слой, содержащий эритроциты и полиморфноядерные гранулоциты, включая нейтрофилы и эозинофилы.

Осторожно удалите верхний слой плазмы, а затем следующий слой, чтобы собрать PBMC. Для мытья заготовленную охристую шерсть ресуспендируйте в 10 миллилитрах PBS или бессывороточной среде RPMI 1640. Центрифугировать пробирку начинают при 500 G в течение 10 минут, чтобы гранулировать клетки.

Выбросьте надосадочную жидкость и повторите стирку еще раз. Затем повторно суспендируйте полученную гранулу в двух миллилитрах полной среды RPMI. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и отрегулируйте концентрацию PBMC до 1 миллиона клеток на миллилитр в полном RPMI.

Для анализа на выброс цитокинов цельной крови в водной фазе берут предварительно отведенный образец цельной крови, добавляют 190 микролитров образца в лунки 96-луночного полистирольного планшета с U-образным дном, термические антитела и реагенты сравнения, предварительно разведенные до 100 мкг на миллилитр в PBS, и добавляют 10 микролитров желаемого разведенного антитела в предназначенные лунки, содержащие 190 микролитров цельной крови. Инкубируйте планшет в течение 48 часов во влажном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия. Для анализа высвобождения цитокинов в твердой фазе PBMC получают предварительно подготовленные пластины с покрытием.

С помощью многоканальной пипетки сбросить раствор антитела с пластин с покрытием. После заполнения резервуара с реагентом PBS трижды промойте пластину 200 микролитрами PBS для удаления несвязанных моноклональных антител. В каждую лунку добавьте по 200 микролитров приготовленной ранее суспензии PBMC.

Инкубируйте планшет в течение 48 часов во влажном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. После 48-часовой инкубации с контрольными и тестовыми моноклональными антителами центрифугируйте планшеты при 400 G в течение пяти минут. Соберите кондиционированную клетку среду или плазму, не повреждая клеточную гранулу.

Заморозьте собранную надосадочную жидкость или плазму при температуре минус 20 градусов Цельсия. Результаты твердофазного анализа PBMC показали, что положительные контрольные антитела индуцировали значительно более высокие уровни цитокинов по сравнению с контрольной группой соответствующего изотипа. Также было замечено, что анти-CD28 суперагонист индуцировал значительно большее изменение высвобождения интерлейкина-2, или IL-2, чем его соответствующий изотип, в то время как анти-CD3 и анти-CD52, продолжая индуцировать экспрессию IL-2, приводили к более низким изменениям.

В анализе всей водной фазы крови уровень определяемых цитокинов был относительно меньше, чем в анализе твердой фазы, но характеризовался большей чувствительностью к стимуляции анти-CD52.