Визуализация внеклеточного ловушки макрофагов с помощью конфокальной микроскопии

Общая цель этого метода — продемонстрировать, как внеклеточные ловушки макрофагов могут быть визуализированы и изучены с помощью конфокальной микроскопии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области воспаления, такие как реакция на инфекцию и другие иммунные стимулы. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она является модификацией хорошо зарекомендовавшего себя метода, который использовался для изучения внеклеточных ловушек нейтрофилов.

Демонстрировать эту процедуру будет Ролин Шарма. После получения макрофагов легких от человека и мышей с помощью бронхоальвеолярного лаважа, или БАЛ, согласно текстовому протоколу, используют трипановый синий и гемоцитометр для проведения подсчета жизнеспособных клеток на растворе БАЛ. Пипетку от одного до четырех раз от 10 до пятой части макрофагов в 500 микролитрах питательной среды на покровные стекла в лунках 24-луночных планшетов, затем инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи, чтобы клетки прилипли.

Удалите питательную среду и используйте PBS для промывки клеток один раз. Затем добавьте 2%-ный параформальдегид-периодат-лизин или фиксатор PLP и инкубируйте образцы в течение 10 минут. После использования PBS для кратковременной промывки клеток добавьте 0,2% TWEEN 20 в PBS и инкубируйте клетки в течение 20 минут.

Далее, чтобы блокировать клетки, добавьте 10%-ную куриную сыворотку в 5%-ную БСА, разведенную в PBS, и инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем замените блочный раствор первичными и изотопными контрольными антителами в концентрации 1:100 и инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение одного часа. После инкубации используйте PBS для промывания клеток перед добавлением соответствующих вторичных антител.

Затем инкубируйте образцы в течение 40 минут при комнатной температуре. После промывки клеток в PBS смонтируйте образцы с помощью монтажной среды на основе DAPI, а затем визуализируйте образцы с помощью конфокального микроскопа. Для предварительной обработки образцов FFPE раствором для извлечения антигена, высушите предметные стекла в духовке при температуре 60 градусов Цельсия в течение 60 минут.

Затем перенесите предметные стекла в раствор ксилола на 30 минут, а затем переместите образцы на 70% этанол при комнатной температуре на пять минут. После использования водопроводной воды для промывки предметных стекол поместите их в термонепроницаемую полиэтиленовую пленку и подвергните их более высокому извлечению антигенов, поместив их в скороварку при pH 9,0 Tris-EDTA на 10 минут. Охладите образцы в течение 20 минут и переложите их в воду из-под крана.

Затем поместите их на качалку на пять минут. Повторите промывку водой из-под крана, а затем промойте слайды один раз в PBS на коромысле. Чтобы заблокировать образцы, добавьте 10% куриную сыворотку в 5% BSA PBS и инкубируйте их при комнатной температуре в течение 30 минут.

Затем, чтобы определить внеклеточные ловушки макрофагов, или МЕТ в макрофагах, добавьте 1 к 100 разведению первичных антител в 1% BSA PBS и инкубируйте слайды при четырех градусах Цельсия в течение 16 часов. Используйте PBS, чтобы промыть образцы два раза на коромысле по пять минут каждый. Добавьте соответствующие флуоресцентные вторичные антитела в 1% BSA PBS и инкубируйте предметные стекла при комнатной температуре в течение 40 минут.

После промывки PBS используйте DAPI, содержащую монтажную среду, чтобы окрасить хроматин и установить образцы. С помощью конфокальной лазерной сканирующей головки, прикрепленной к инвертированному микроскопу, можно получить флуоресцентные изображения с использованием воздушных объективов с концентрацией 20X 0,1 NA и масляной концентрацией 40X 1,0 NA. Захватывайте изображения в одной плоскости размером 512 на 512 пикселей, нажав кнопку выравнивания последовательности линий.

Получите не менее 10 полей обзора на раздел для анализа и данных для каждого результата. Чтобы окрашивать срезы в микроцентрифужных пробирках, добавьте соответствующие первичные антитела в объемах 200 микролитров и инкубируйте образцы при четырех градусах Цельсия в течение 16 часов. Промойте срезы в PBS три раза в течение 10 минут, прежде чем добавить соответствующие вторичные антитела и инкубировать образцы при комнатной температуре в течение одного часа.

Используйте DAPI для окрашивания срезов легких в раствор и инкубируйте образцы в течение 20 минут, прежде чем добавлять покровные листы к срезам на предметных стеклах микроскопа в PBS. Используйте инвертированный конфокальный микроскоп с объективом 40X 1,3 NA, оснащенный лазерами 405 нанометров, 440 нанометров, 473 нанометров, 543 нанометров и 635 нанометров, для получения изображений и записи стеков 3D Z толщиной 0,54 микрона с оптимальным Z-сечением. Наконец, проанализируйте изображения в соответствии с текстовым протоколом.

Пример MET в образце BAL показан здесь. Первой обнаруживаемой особенностью является перемещение ядра к краю клетки, как видно на этой ранней стадии MET, которая имеет примерно сферическую форму. За ним следует внеклеточный хроматин с другими ко-экспрессируемыми медиаторами, такими как H3Cit и гранулярные протеазы, как видно в этом более зрелом МЕТ.

Более ранняя стадия MET находится вверху слева, а более поздняя стадия MET находится ниже этого уровня ближе к центру. МЕТ легочной ткани показаны на этом рисунке. По мере того, как легкие надуваются жидкостью для определения архитектуры легких, MET будут прижиматься к альвеолярным стенкам.

Морфология МЕТ также будет варьироваться в зависимости от того, в какой плоскости была разрезана ткань. Стандартные срезы, используемые для образцов легочной ткани, имеют толщину от четырех до пяти микрон. Более толстые срезы тканей позволяют делать несколько изображений, а затем просматривать MET в 3D.

Здесь представлен пример 3D-изображения из легочной ткани мыши, разрезанной на срезы от 25 до 35 микрон. После освоения эта техника может быть выполнена за два дня окрашивания плюс визуализация, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о бережном подходе к мытью.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как зимография, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как экспрессия протеазы. После его разработки этот метод может открыть путь к изучению воспалительных реакций макрофагов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как визуализировать МЕТ с помощью конфокальной микроскопии.

Не забывайте, что работа с PLP может быть опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и защиты глаз.