Флуоресценции Live клеточной изображений полный вегетативных клеточный цикл из медленно растущих социальных бактерия Myxococcus Ксанф

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии бактериальных клеток, например, как клетки реплицируют свою ДНК, как они растут и как делятся. Основное преимущество этой методики заключается в том, что живые бактериальные клетки можно контролировать под микроскопом не менее 24 часов, и методика не требует специального оборудования. Хотя этот метод может дать представление о росте и делении Myxococcus xanthus, он также может быть легко применен к другим медленно растущим бактериям.

Для начала повторно суспендируйте одну колонию M.xanthus в 500 микролитрах 1%-ного CTT, дополненного антибиотиками, в стерильной пробирке и переложите всю суспензию в 50-миллилитровую колбу Эрленмейера, содержащую пять миллилитров 1%-ного CTT. Приготовьте 1%-ный раствор агарозной микроскопии, содержащий 0,2%CTT, смешав один грамм агарозы с 80 миллилитрами буфера TPM и 20 миллилитрами 1%-ной среды CTT. Разогрейте раствор в микроволновой печи до тех пор, пока агароза не расплавится.

Наполните чашку Петри примерно 60 миллилитрами расплавленной агарозы и дайте ей остыть до комнатной температуры. Предварительно нагрейте агарозную подушечку при температуре 32 градуса Цельсия не менее чем за 15 минут до использования. Далее поместите стерильный стеклянный покров на пластиковую или металлическую раму, которая имеет отверстие посередине, затем с помощью ленты закрепите покров к раме.

Добавьте от 10 до 20 микролитров экспоненциально выращенных клеток M.xanthus на покровную крышку. Чтобы добавить флуоресцентные микросферы в качестве реперных маркеров клеток, используйте буфер TPM для разбавления микросфер до соотношения 1:100. Тщательно встряхните шариковую суспензию и добавьте в ячейки от пяти до 10 микролитров.

Из большой, предварительно прогретой 1%-ной агарозной подушечки вырежьте небольшую подушечку размером примерно с покровную подушечку и положите ее поверх ячеек. Затем наденьте на прокладку крышку, чтобы предотвратить испарение и сохранить клетки во влажной среде. Инкубируйте образец микроскопии при температуре 32 градуса Цельсия в течение 15-20 минут, чтобы клетки прикрепились к дну агарозной прокладки перед записью покадровой микроскопии.

Чтобы провести покадровую микроскопию, включите микроскоп и запустите программное обеспечение для управления микроскопом. Выберите правильный объектив и правильные зеркала и фильтр для получения фазово-контрастных изображений, а также изображений зелено-флуоресцентных, красных флуоресцентных или желто-флуоресцентных белков. Добавьте каплю высококачественного иммерсионного масла на линзу объектива и на дно образца, предварительно инкубированного при температуре 32 градуса Цельсия.

Положите металлическую рамку с образцом на предметный столик микроскопа стороной к объективу, затем надежно закрепите образец в держателе предметного столика. Сосредоточьтесь на ячейках, переместив рабочую область в направлении Z ближе к цели. Когда масло на объективе и образце соприкоснется, переместите предметный столик в направлении X/Y.

Переключитесь на программу Metamorph и откройте инструмент «Приобретение». Выберите «Фазовый контраст» в раскрывающемся списке «Настройка» и установите время экспозиции на 100 миллисекунд. Нажмите «Показать в реальном времени», «Переместить ячейку в фокальную плоскость» и перемещайте рабочую область в направлении X/Y, пока в поле зрения не появятся несколько отдельных ячеек.

Убедитесь, что в области обзора находится хотя бы одна флуоресцентная микросфера, чтобы впоследствии выровнять полученные изображения. Затем откройте мастер многомерного сбора данных программного обеспечения для управления микроскопом, чтобы настроить покадровую съемку, которая позволит микроскопу получать изображения на разных длинах волн и в разных положениях столика, если это необходимо. Во вкладке «Основные» активируйте интервальную съемку и «Несколько длин волн».

В левой части окна появятся дополнительные вкладки. Перейдите на вкладку «Сохранение» и выберите «Каталог», чтобы выбрать пустую папку на жестком диске компьютера для сохранения полученных изображений, затем активируйте функцию «Увеличить базовое имя, если файл существует», чтобы убедиться, что последовательные наборы данных не перезаписывают предыдущие. Присвойте эксперименту название с указанием даты и название сорта или название эксперимента.

Перейдите на вкладку «Интервальная съемка», чтобы настроить параметры интервальной съемки, затем установите Интервал времени на 20 минут и Продолжительность на 24 часа. Количество временных точек будет меняться автоматически. Теперь нажмите на вкладку «Длины волн».

Выберите количество длин волн для получения для каждого изображения в каждый момент времени, изменив число. Выберите «Разрешить отдельное аппаратное запоминание положения автофокусировки» для каждой длины волны. Перейдите на вкладку «Длина первой волны» сверху.

В раскрывающемся списке Освещение выберите Фазовый контраст. Выберите 100 миллисекунд для экспозиции и в раскрывающемся списке Сбор выберите Каждая временная точка. Отключите функцию «Автофокусировка» в раскрывающемся списке, выбрав «Никогда», и выберите «Каждое приобретение» в раскрывающемся списке для параметра «Автофокус».

Установите экспозицию для каждой длины волны, как показано на рисунке, используя следующие параметры. Затем, чтобы получить изображения с нескольких позиций сцены, на вкладке «Главная» активируйте функцию «Несколько позиций сцены». Перейдите на вкладку «Сцена» и нажмите кнопку «Трансляция», чтобы посмотреть на поле зрения.

Перемещайте рабочую область в направлении X/Y, пока в поле зрения не окажется ROI. Сохраните координаты X и Y на вкладке Stage, нажав на знак плюса. Снова переместите рабочую область в направлении X/Y, пока не будет найден новый ROI, и снова сохраните координаты, щелкнув знак плюса.

Продолжайте до тех пор, пока не будет сохранено нужное количество регионов. Еще раз убедитесь, что ячейки находятся в фокусе, щелкнув по различным сохраненным позициям X и Y, и запустите аппаратную автофокусировку, нажав кнопку AFC Hold, чтобы сохранить сохраненную Z-позицию постоянной в течение всего эксперимента. Запустите покадровую съемку в мастере многомерного сбора данных программного обеспечения для управления микроскопом, нажав кнопку «Захватить».

Убедитесь, что ячейки все еще находятся в фокусе после первых нескольких временных точек в интервальной записи, чтобы максимизировать качество изображений и при необходимости перефокусироваться. Чтобы создать цейтраферные видеоролики и выполнить выравнивание изображений, запустите программное обеспечение для анализа и обработки изображений. Откройте изображения в виде стопки, нажав «Просмотреть многомерные данные», «Выбрать базовый файл», «Выбрать каталог», затем открыть папку с многомерными данными.

Проверьте набор данных и нажмите кнопку Просмотр. Набор данных будет отображаться в виде отдельных изображений от первой точки времени до конца. Активируйте длину волны для создания стека, затем выберите все изображения, которые должны быть в стеке и нажмите Загрузить изображения.

Повторите этот шаг для всех длин волн и сохраните готовые стеки. Активируйте стек изображений, который нужно скорректировать на дрифт. Откройте инструмент выравнивания с помощью Приложения, Автовыравнивание.

Отметьте Стек в качестве источника изображений и Первую плоскость/временную точку в качестве опорной плоскости, затем выберите стек с помощью кнопки Исходный стек и нажмите Применить. Когда автоматическое выравнивание будет завершено, сохраните выровненный стек. Чтобы сгенерировать фильм в форматах MOV или AVI, откройте функцию Make Movie через Stack, Make Movie.

Выберите интервальную съемку с помощью кнопки «Стек источника», затем выберите формат вывода, частоту кадров, количество кадров и нажмите «Сохранить». В этом покадровом эксперименте с подвижными клетками дикого типа DK1622 фазово-контрастные изображения получались каждые пять минут в течение 24 часов. Как и ожидалось, клетки были подвижны и преимущественно перемещались группами.

При фазовоконтрастной визуализации живых клеток с неподвижными клетками Delta-mgIA наблюдался рост и деление отдельных клеток во время формирования микроколоний. Когда изображения получались каждые пять минут в течение 24 часов, стало возможным количественно оценить время межделения 235 плюс-минус 50 минут при разрешении одной ячейки. Чтобы выяснить, нормально ли растут клетки при отслеживании yfp-меченых белков в течение длительных периодов времени, отслеживались клетки M.xantithus, экспрессирующие ParB-YFP.

ParB-YFP первоначально образовывал единый кластер в области субполярных ячеек. Незадолго до или после деления клетки кластер дуплицировался, при этом один кластер оставался на старом клеточном полюсе, а второй перемещался на новый клеточный полюс. В этом эксперименте неподвижные клетки, экспрессирующие FtsZ-gfp, показали сильное накопление FtsZ-gfp в средней клетке, что диктует положение деления клетки.

FtsZ-gfp образовывали кластер в средней ячейке, преимущественно в более длинных клетках. Через два часа после деления клетки FtsZ-gfp накапливался в середине клетки в дочерних клетках. Как только этот метод будет освоен, его можно будет регулярно применять на Myxococcus xanthus, а также на любой другой медленно растущей бактерии.

При настройке этой процедуры для бактерии важно скорректировать состав питательной среды в агаровой пластине в соответствии с конкретными потребностями роста этой бактерии. Для любой бактерии важно определить оптимальные условия визуализации, такие как время воздействия, интенсивность света и частота визуализации, чтобы избежать фототоксичности. Кроме того, для любого флуоресцентно меченного белка условия визуализации должны быть скорректированы, чтобы избежать фототоксичности, а также фотообесцвечивания.