ДНК, окрашивание метод, основанный на Формазаны осадков, вызванных синий освещенности
28 января 2018 г.
Этот метод позволяет селективного окрашивания и количественного определения ДНК в гелях путем замачивания геля в зеленом SYBR я / нитро синий Tetrazolium решения и затем подвергая его солнечного света или синий источник света. Это создает видимый преципитат и почти не требует оборудования, что делает его идеальным для использования на местах.
Протокол окрашивания ДНК состоит из трех основных этапов. Первый заключается в том, чтобы поместить гель в раствор SYBR Green I и нитро синего тетразолия, также известного как NBT. Затем гель перемешивают в течение 25 минут, если это полиакриламидный гель, и час, если это агарозный гель.
Последним шагом является воздействие на гель синего источника света, такого как синие светодиоды или солнечный свет. На этом этапе появляются полосы осадка. Эти полосы имеют прямую корреляцию с концентрацией ДНК, и гель затем может быть оцифрован в офисном сканере для количественной оценки ДНК.
Для полиакриламидного геля готовят неденатурирующий полиакриламидный гель. Затем в гель загружаются образцы, и начинается процесс электрофореза. В настоящее время готовятся растворы SYBR Green I, разбавленные до 1,2X, и NBT 20 миллимолярные растворы.
Гель помещают в пластиковый контейнер и добавляют 16,75 мил разбавленного SYBR Green I и 325 мил NBT при концентрации 20 миллимоляров. Затем емкость накрывают парапленкой и алюминиевой фольгой и перемешивают при 60 оборотах в минуту в течение 25 минут. Наконец, алюминиевая фольга и парапленка удаляются, и гель подвергается воздействию солнечных лучей или синего источника света.
Для количественной оценки полос и калибровочных кривых гель помещается в офисный сканер, а затем изображение анализируется с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Наконец, делается прививка нормализованного сигнала в зависимости от концентрации. Изготавливается агарозный гель.
Лунки загружаются плазмидой, которая обладает устойчивостью к ампициллину, и гель разрезается на две части, каждая из которых окрашивается своим окрашиванием. Затем плазмидная полоса извлекается и преобразуется путем химического преобразования в компетентные клетки с помощью среды, содержащей ампициллин. 1%-ный агарозный гель получают в буфере TAE 1X и содержат четыре микролитра плазмиды в концентрации около 100 нанограмм на микролитр.
Затем гель в камере электрофореза запускается при напряжении 100 вольт в течение одного часа. Половина геля окрашивается методом SYBR Green I и NBT, а другая половина – методом УФ-излучения SYBR Green I. Для агарозного геля метод SYBR Green I NBT выполняется с использованием SBYR Green I в концентрации 1,2X и NBT в концентрации 2 миллимоль.
Гель помещают в пластиковый контейнер, а объем раствора масштабируют, чтобы покрыть гель, а время перемешивания продлевают до одного часа. Для агарозных гелей обычно используемый метод SYBR Green I выполняется путем покрытия геля 1X раствором SYBR Green I и перемешивания в течение часа. Затем гель подвергается воздействию УФ-трансиллюминатора для визуализации ленты в течение двух минут.
После окрашивания геля плазмидная лента разрезается скальпелем, и плазмида извлекается с помощью коммерческого набора для экстракции. ДНК нормализуется до 9,1 нанограмм на микролитр для трансформации химически компетентных бактерий Escherichia coli XL 10. Наконец, подсчитываются колонии.
Подсчитываются колониеобразующие единицы. В результате проводится прививка и сравниваются результаты, полученные с помощью SYBR Green I NBT и SYBR Green I UV. В месте расположения ДНК появляется осадок фиолетового цвета.
В эксперименте была загружена лестница ДНК для построения калибровочной кривой с пределом обнаружения 192 пикограмма на 1500 парах оснований. Использование агарозных гелей позволяет получить образец с помощью коммерчески доступного набора и не препятствует экстракции. Некоторое восстановление с использованием этого метода с синим светодиодом приводит к лучшему качеству по сравнению с SYBR Green I с использованием трансиллюминатора.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Данный метод позволяет проводить селективное окрашивание и количественное определение ДНК в гелях с использованием раствора SYBR Green I/нитробелого тетразолия. Процесс требует минимального набора оборудования, что делает его подходящим для применения в полевых условиях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биохимия
- Молекулярная биология
- Полевые исследования
Теоретические основы
- Количественное определение ДНК имеет важное значение для различных биологических исследований.
- Традиционные методы часто требуют использования сложного оборудования.
- Данный метод значительно упрощает этот процесс.
- Используются общедоступные реагенты для получения эффективных результатов.
Цель исследования
- Разработать простой метод окрашивания ДНК.
- Обеспечить возможность количественного определения ДНК в гелях различных типов.
- Облегчить проведение полевых работ при минимальных требованиях к оборудованию.
Используемые методы
- Замачивание геля в растворе SYBR Green I и NBT.
- Перемешивание геля в течение 25 минут (полиакриламидный) или 1 часа (агарозный).
- Экспонирование геля под источником синего света или солнечным светом.
- Дигитализация геля для количественного определения ДНК.
Основные результаты
- Видимые полосы осадка коррелируют с концентрацией ДНК.
- Эффективное окрашивание достигается при использовании минимального набора оборудования.
- Результаты могут быть количественно определены с помощью стандартных офисных сканеров.
- Метод демонстрирует надежность в полевых условиях.
Выводы
- Данный метод представляет собой практический подход к количественному определению ДНК.
- Он подходит для различных типов гелей и применения в полевых условиях.
- Метод расширяет возможности исследователей, работающих в отдаленных регионах.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для отрасли
Данный метод окрашивания ДНК позволяет напрямую визуализировать и количественно определять нуклеиновые кислоты без использования специализированного оборудования, что способствует быстрой валидации мишени в условиях ограниченных ресурсов. Благодаря устранению зависимости от УФ-трансиллюминаторов, он снижает риски для безопасности и упрощает операционную сложность в рабочих процессах на ранних этапах поиска. Данный подход повышает достоверность прогнозов за счет воспроизводимой корреляции сигнала красителя с концентрацией ДНК, что облегчает принятие решений о продолжении или прекращении работ в конвейерах идентификации ведущих соединений.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять гипотезы посредством прямой корреляции между интенсивностью осадка формазана и концентрацией ДНК, что способствует оценке связывания с мишенью.
- Операционная ценность: использует перемешивание при комнатной температуре и воздействие синего света, что позволяет избежать использования опасных протоколов с УФ-излучением и специализированного оборудования для визуализации.
- Прогностическая ценность: обеспечивает количественный результат, совместимый с офисными сканерами, что позволяет быстро сравнивать выход нуклеиновых кислот при различных экспериментальных условиях.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: образуются стабильные видимые полосы осадка, которые служат стандартизированными показателями для форматов высокопроизводительного скрининга нуклеиновых кислот.
- Воспроизводимость: определенное время перемешивания (25 мин для полиакриламида, 60 мин для агарозы) и масштабируемые концентрации реагентов обеспечивают стабильное генерирование сигнала в разных партиях.
- Совместимость с платформами: метод работает как с агарозными, так и с полиакриламидными гелями, что позволяет легко интегрировать его в существующие рабочие процессы электрофореза для анализа вариантов или плазмид.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает восстановление функциональных плазмид после окрашивания, что подтверждается более высоким числом колониеобразующих единиц по сравнению с методами на основе УФ-излучения, позволяя проводить последующую функциональную валидацию.
- Снижение механических рисков: позволяет избежать повреждения ДНК, индуцированного УФ-излучением, сохраняя целостность образцов для точного сопоставления генотипа и фенотипа в анализах фенотипического скрининга.
- Доклиническая применимость: позволяет проводить количественную оценку конструкций экспрессии генов или вирусных титров в доклинических моделях в полевых условиях без использования лабораторной инфраструктуры.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в общую последовательность этапов исследования — от экстракции нуклеиновых кислот до валидации функционального анализа, что особенно актуально в условиях ограниченного доступа к оборудованию или при необходимости быстрой итерации.
- Биология открытий: способствует валидации мишеней, обеспечивая количественное считывание ДНК, которое коррелирует с эффективностью транскрипции или редактирования в исследованиях модуляции путей.
- Скрининг: позволяет проводить стандартизированный количественный анализ нуклеиновых кислот для подтверждения попаданий в библиотеках CRISPR или библиотеках сверхэкспрессии, что повышает воспроизводимость анализа.
- Аналитика: позволяет получать линейные кривые «сигнал-концентрация» с помощью сканирования на офисном сканере, что поддерживает нормализацию данных для форматов на основе многолуночных планшетов или гелей.
- Трансляционные исследования: облегчают выделение неповрежденных нуклеиновых кислот для функциональных анализов in vitro, связывая этап открытий с доклиническими испытаниями эффективности.
- Корпоративное повторное использование: требует только SYBR Green I, NBT и источник синего света, что делает этот метод недорогим и применимым модулем для нескольких проектных групп.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неоднозначность за счет исключения артефактов, индуцированных УФ-излучением, что повышает достоверность данных в анализах по валидации мишеней.
- Операционная ценность: Устраняет необходимость в темных комнатах или транслюминаторах, что увеличивает пропускную способность и сокращает количество «узких мест» в общих центрах коллективного пользования.
- Стратегическая ценность: Снижает капитальные затраты на количественное определение нуклеиновых кислот, позволяя проводить децентрализованное тестирование в дочерних лабораториях или на партнерских площадках.
- Влияние на портфель: Поддерживает продвижение проектов с учетом рисков, обеспечивая раннее, не зависящее от оборудования подтверждение выхода конструкта перед инвестированием в последующую очистку.
Особенности реализации
- Требуется базовая подготовка в области молекулярной биологии для приготовления гелей и проведения электрофореза.
- Необходим доступ к источнику синего света (например, светодиодам с длиной волны 470 nm) или солнечному свету, а также стандартное лабораторное оборудование для перемешивания.
- Требуется соблюдение стандартизированного времени окрашивания и концентраций реагентов для обеспечения воспроизводимости результатов между разными лабораториями.
- Из-за этапов ручного манипулирования с гелями может потребоваться оптимизация для форматов с высокой пропускной способностью.
- Метод ограничен детектированием нуклеиновых кислот; не применим для анализа белков или малых молекул без соответствующей адаптации.
