ДНК, окрашивание метод, основанный на Формазаны осадков, вызванных синий освещенности

Протокол окрашивания ДНК состоит из трех основных этапов. Первый заключается в том, чтобы поместить гель в раствор SYBR Green I и нитро синего тетразолия, также известного как NBT. Затем гель перемешивают в течение 25 минут, если это полиакриламидный гель, и час, если это агарозный гель.

Последним шагом является воздействие на гель синего источника света, такого как синие светодиоды или солнечный свет. На этом этапе появляются полосы осадка. Эти полосы имеют прямую корреляцию с концентрацией ДНК, и гель затем может быть оцифрован в офисном сканере для количественной оценки ДНК.

Для полиакриламидного геля готовят неденатурирующий полиакриламидный гель. Затем в гель загружаются образцы, и начинается процесс электрофореза. В настоящее время готовятся растворы SYBR Green I, разбавленные до 1,2X, и NBT 20 миллимолярные растворы.

Гель помещают в пластиковый контейнер и добавляют 16,75 мил разбавленного SYBR Green I и 325 мил NBT при концентрации 20 миллимоляров. Затем емкость накрывают парапленкой и алюминиевой фольгой и перемешивают при 60 оборотах в минуту в течение 25 минут. Наконец, алюминиевая фольга и парапленка удаляются, и гель подвергается воздействию солнечных лучей или синего источника света.

Для количественной оценки полос и калибровочных кривых гель помещается в офисный сканер, а затем изображение анализируется с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Наконец, делается прививка нормализованного сигнала в зависимости от концентрации. Изготавливается агарозный гель.

Лунки загружаются плазмидой, которая обладает устойчивостью к ампициллину, и гель разрезается на две части, каждая из которых окрашивается своим окрашиванием. Затем плазмидная полоса извлекается и преобразуется путем химического преобразования в компетентные клетки с помощью среды, содержащей ампициллин. 1%-ный агарозный гель получают в буфере TAE 1X и содержат четыре микролитра плазмиды в концентрации около 100 нанограмм на микролитр.

Затем гель в камере электрофореза запускается при напряжении 100 вольт в течение одного часа. Половина геля окрашивается методом SYBR Green I и NBT, а другая половина – методом УФ-излучения SYBR Green I. Для агарозного геля метод SYBR Green I NBT выполняется с использованием SBYR Green I в концентрации 1,2X и NBT в концентрации 2 миллимоль.

Гель помещают в пластиковый контейнер, а объем раствора масштабируют, чтобы покрыть гель, а время перемешивания продлевают до одного часа. Для агарозных гелей обычно используемый метод SYBR Green I выполняется путем покрытия геля 1X раствором SYBR Green I и перемешивания в течение часа. Затем гель подвергается воздействию УФ-трансиллюминатора для визуализации ленты в течение двух минут.

После окрашивания геля плазмидная лента разрезается скальпелем, и плазмида извлекается с помощью коммерческого набора для экстракции. ДНК нормализуется до 9,1 нанограмм на микролитр для трансформации химически компетентных бактерий Escherichia coli XL 10. Наконец, подсчитываются колонии.

Подсчитываются колониеобразующие единицы. В результате проводится прививка и сравниваются результаты, полученные с помощью SYBR Green I NBT и SYBR Green I UV. В месте расположения ДНК появляется осадок фиолетового цвета.

В эксперименте была загружена лестница ДНК для построения калибровочной кривой с пределом обнаружения 192 пикограмма на 1500 парах оснований. Использование агарозных гелей позволяет получить образец с помощью коммерчески доступного набора и не препятствует экстракции. Некоторое восстановление с использованием этого метода с синим светодиодом приводит к лучшему качеству по сравнению с SYBR Green I с использованием трансиллюминатора.