Количественная оценка одноклеточных темпы деградации белка с покадровой флуоресцентной микроскопии в культуре адэрентных клеток

Общая цель этого подхода к флуоресцентной визуализации заключается в определении периода полураспада интересующего белка в отдельных живых клетках с помощью SNAP-метки. Клеточные белки подвергаются обширному переработке, при этом скорость синтеза и деградации специфична для каждого белка и подвержена физиологической регуляции. Тем не менее, наиболее часто используемые методы определения периода полувыведения белка либо ограничены средними популяционными значениями из клеток вшей, либо требуют использования ингибиторов синтеза белка.

В этом видео мы демонстрируем, как SNAP-метка в сочетании с флуоресцентной покадровой микроскопией может быть использована для измерения периода полураспада белка в живых клетках. Преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет достичь разрешения для отдельных клеток и, следовательно, дает оценку гетерогенности периодов полураспада в популяции культивируемых клеток. Представленная здесь экспериментальная методика может быть применена к любому типу адгезивных культивируемых клеток, экспрессирующих представляющий интерес белок, слитый с SNAP-меткой.

Это может быть достигнуто либо за счет эндогенного мечения белков, либо за счет использования сверхэкспрессии меченых белков. SNAP-метка представляет собой мутантную версию фермента репарации ДНК, O6-алкилгуанин-ДНК-алкилтрансферазы, которая специфически реагирует с бензилгуанином, который может быть связан с молекулярными зондами. Таким образом, любой гибридный белок SNAP-tag может быть необратимо помечен красителем, проницаемым для флуоресцентных клеток.

После вымывания остаточного красителя популяция меченого белка будет распадаться экспоненциально, и можно сделать вывод о периоде полураспада соответствующего белка. В этом видео мы используем эмбриональные стволовые клетки, которые образуют плотные колонии при выращивании классическим способом на посуде, покрытой желатиновой оболочкой. Чтобы позволить им расти в качестве монослоя клеток и, таким образом, достичь разрешения одной клетки для экспериментов по визуализации флуоресценции, мы культивировали их на пластинах с покрытием, адгезирующим клетку, что редуцирует клетку к клеточным взаимодействиям, опосредованным клеточным адгезионом, экспрессируемым на плазматической мембране.

Разбавьте рекомбинантную жидкость в дозе пять нанограмм на микролитр в PBS и добавьте 30 микролитров разбавленной жидкости на клапан в пластине с 96 клапанами, пригодной для визуализации. Избегайте чрезмерного дозирования, так как рекомбинантное прилипание очень хрупкое. Выдерживать при температуре 37 градусов в течение полутора часов.

Отсадите адгезивный раствор, промойте один раз 100 микролитрами PBS и добавьте до 200 микролитров предварительно гельминтизированной питательной среды. Используйте линии ESL, экспрессирующие интересующий вас белок, слитый с SNAP-меткой. Промойте клетки пятью мл PBS.

Затем добавьте два мл Трипсона, и выдерживайте четыре минуты при 37 градусах. Добавьте четыре мл питательной среды ESL, повторно суспендируйте и уменьшите при 1000 Т в течение четырех минут. Аспирируйте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте в свежей среде и подсчитайте клетки.

Посадите 30 000 клеток на квадратный сантиметр в пластине с наклеенным покрытием. Продолжайте окрашивание красителем SNAP через 24 часа после посадки в ячейку. Развести клеточный краситель в культуральной среде ELS до оптимальной концентрации, определенной ранее.

Отсадите среду с помощью пипетки и осторожно добавьте 50 микролитров разведенного красителя SNAP. Выдерживать 30 минут при температуре 37 градусов. Отсадите краситель и трижды промыть 200 микролитрами предчервячного PBS.

Добавьте 200 микролитров питательной среды ESL, и выдерживайте 15 минут при 37 градусах. Выполняйте промывку с помощью аккуратного пипетирования и не используйте автоматический аспиратор, так как клетки имеют тенденцию легко отделяться. Повторите те же действия промывки еще дважды, затем добавьте 200 микролитров носителя для визуализации.

Используйте феноловый красный свободный средний для уменьшения фона цветения. Используйте микроскоп с контролируемой температурой и CO2. Установите температуру на 37 градусов и CO2 на пять процентов перед использованием и дайте равновесию в течение одного-двух часов.

Поместите пластину в микроскоп и выберите место, подходящее для визуализации. На изображениях яркого поля видно, что ESL прикреплена к прилипшей к покрытой чашке в монослое. Выберите цель, цель 20X подходит для этого размера ESL.

Выберите настройки подсветки для канала цветения, который будет записываться. Отрегулируйте мощность лазера и экспозицию для получения сильного сигнала, так как он будет уменьшаться по ходу фильма. Выберите параметры сбора данных для эксперимента с замедленной съемкой.

Для белков с ожидаемым периодом полураспада от двух до двадцати часов выбирайте время получения от 12 до 24 часов с временными интервалами 15 минут. Запустите эксперимент с визуализацией. Используйте программное обеспечение FIJI для обработки и анализа фильма.

Соберите полученные изображения в стопку и деформируйте ее. Используйте функцию вычитания фона FIJI, чтобы удалить фон со всех изображений в стопке. Выберите интересующую ячейку, нарисуйте вокруг нее область интереса с помощью панели инструментов FIJI и добавьте интересующую область в Менеджер ROI.

Переходите к следующему кадру и повторяйте предыдущие действия. Следите за интересующей вас ячейкой на протяжении всего фильма и сохраняйте набор ROI для каждой отслеживаемой ячейки. Щелкните Измерить, чтобы получить значения средней интенсивности и площади ROI.

Чтобы оценить локальный фон, добавьте область интереса рядом с ячейкой интереса для каждого таймфрейма. В конце нажмите кнопку Измерить, чтобы получить значения средней интенсивности фона. Сначала вычислим среднюю интенсивность ячейки, умножив полученное значение на среднюю интенсивность ROI ячейки на ее площадь.

Затем перейдите к вычислению интегрированного фонового значения ячейки, умножив среднюю интенсивность фонового ROI на площадь ROI ячейки. Наконец, чтобы получить фоновое скорректированное значение интегральной интенсивности ячейки, вычтите интегральное значение фоновой интенсивности из интегрального значения интенсивности ячейки. Для получения среднего периода полураспада популяции клеток нормализуем полученные значения к значению интенсивности первого кадра для каждой клетки.

Это гарантирует, что каждая клетка вносит одинаковый вклад в среднее значение периода полураспада независимо от ее абсолютной интенсивности цветения. После деления клетки отслеживайте обе дочерние клетки отдельно и суммируйте их интегрированные интенсивности после фонового вычитания, чтобы учесть разведение белка во время деления клетки. Сохраните наборы ROI для обеих дочерних ячеек.

Для оценки периода полураспада белка используйте инструмент подгонки кривой в MATLAB. Распад белка происходит по экспоненциали, где F(x) — интенсивность цветения в данный момент времени, a — начальная интенсивность, а b— скорость распада. После получения значений скорости распада b"от подгонки, период полураспада может быть рассчитан путем деления логарифма двух на b"В этом фильме показан распад флуоресценции красителя SNAP в непригодной для использования клеточной линии SNAP-tag с четырьмя метками.

Наблюдаемый сигнал флуоресценции будет зависеть от используемой клеточной линии, уровня экспрессии соответствующего белка, представляющего интерес, а также от свойств используемого красителя. Для экспериментов по распаду белка важно использовать адекватную концентрацию красителя SNAP. Концентрация должна быть достаточно высокой, чтобы в начале таймлапса подавался яркий сигнал цветения.

Однако использование слишком высоких концентраций красителя может привести к тому, что остаточный краситель останется в среде даже после стирки. Свободный краситель может впоследствии связываться с вновь произведенными молекулами SNAP-tag в течение фильма, что исказит кривую распада. Поэтому крайне важно оптимизировать концентрацию красителя SNAP путем тестирования различных разведений.

На этом рисунке показаны кривые распада для восьми различных концентраций флуоресцентного красителя SNAP, протестированного на непригодной для использования клеточной линии доксициклина. Начальная концентрация красителя в три микромоляра была выбрана в соответствии с инструкциями производителя по визуализации живых клеток, и проводилось серийное разведение от одного до трех до достижения концентрации 1,4 наномоляра. Для двух самых высоких концентраций сигнал не уменьшается, в то время как наблюдаемое затухание следует экспоненциальной кривой для более низких концентраций.

В данном примере была выбрана оптимальная концентрация 12 наномоляров, так как такая концентрация обеспечивает минимальное количество остаточного красителя, остающегося в среде после промывки, но сигнал флуоресценции все еще достаточно яркий, чтобы можно было наблюдать четкую кривую распада. Описанный протокол обеспечивает оценку межклеточной вариабельности и периода полураспада для любого данного белка, слитого с SNAP-меткой. На этом рисунке показаны распады одиночных клеток и среднее значение популяции для трех различных непригодных для использования линий доксициклиновых клеток SNAP-tag.

Nanog" и Oct4" довольно короткоживущие, со средним периодом полураспада 2,9 и 4,8 часа. В то время как Srsf11" живет дольше, имея средний период полураспада 25,3 часа. Ящичковые диаграммы показывают распределение периодов полураспада для трех белков.

Мы показали, что использование SNAP-метки в сочетании с флуоресцентной покадровой микроскопией позволяет определить период полураспада любого белка, представляющего интерес. Измерения распада одиночных клеток позволяют оценить гетерогенность периода полураспада в популяции клеток, которая опускается при использовании других методов определения периода полураспада белка. Одним из наиболее важных шагов при использовании SNAP-метки для мониторинга распада белка является обеспечение того, чтобы после промывки в среде или в клетках не осталось остаточного несвязанного красителя.

В противном случае он может связываться с вновь образованными молекулами SNAP-tag позже в ходе эксперимента и тем самым нарушать кривую распада. С одной стороны, это достигается за счет тщательного выполнения всех описанных этапов мойки. С другой стороны, концентрация красителя SNAP должна быть как можно ниже, но при этом находиться в диапазоне, позволяющем получить хорошее соотношение сигнал/шум.

Концентрация красителя SNAP должна быть оптимизирована для каждого эксперимента в соответствии с клеточной линией и типом используемого красителя. Хотя возможно, что SNAP-метка может изменять период полураспада белков-кандидатов в некоторых случаях, мы не видим доказательств таких эффектов, поскольку определенные периоды полураспада тестовых белков-кандидатов соответствуют близко совпадающим опубликованным значениям. Чтобы еще больше исключить влияние SNAP-метки на деградацию белка, одним из вариантов может быть блокирование синтеза белка циклогексимидом и проведение блоттинга в туалете в разные моменты времени с использованием антитела, которое распознает местный белок.

И напрямую сравнить распад белка-кандидата SNAP-tag с немеченой местной версией.