Пространственного и временного управления активации Т-клеток с помощью агонист Photoactivatable

Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы описать использование фотоактивируемого пептида MHC для индуцирования поляризованной передачи сигналов в Т-лимфоцитах. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области передачи сигналов иммунных клеток, такие как то, как лимфоциты преобразуют быстрые локализованные сигналы, а затем формируют поляризованные клеточные ответы на эти сигналы. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она обеспечивает пространственно-временной контроль передачи сигналов Т-клетками.

Он делает это путем фиксации точного времени и места активации Т-клеточных рецепторов. Демонстрировать процедуру будет Элиза Санчес, аспирантка из моей лаборатории. Начните с добавления биотинилированного поли-L-лизина, или био-PLL, разбавленного в соотношении от одного до 500 в дистиллированной деионизированной воде, в покровное стекло с восемью камерами.

Выдерживать 30 минут при комнатной температуре. После инкубации промойте дистиллированной деионизированной водой, а затем высушите в течение двух часов при комнатной температуре. Блокируйте поверхности с покрытием био-PLL блокирующим буфером, состоящим из буферного раствора HEPES с 2% БСА в течение 30 минут при комнатной температуре.

После инкубации удалите блокирующий буфер с поверхностей с покрытием био-ФАПЧ, не допуская высыхания лунок. Затем добавьте стрептавидин и инкубируйте при четырех градусах Цельсия. Через час вымойте покрытые поверхности в HBS.

Заполните и переверните камеру шиберных колодцев четыре-пять раз, удаляя HBS из лунок. Не допускайте пересыхания лунок. Добавьте специфические биотинилированные фотоактивируемые пептидные лиганды и молекулы адгезии для CD4-положительных Т-клеток или CD8-положительных клеток на поверхности, покрытые био-ФАПЧ.

Беречь от света и выдерживать в течение часа при комнатной температуре. После инкубации вымыть, как и раньше, и оставить в HBS до готовности к посеву. Наконец, добавьте 200 000 CD4-положительных или CD8-положительных Т-клеток, экспрессирующих соответствующий TCR, в соответствующие лунки и дайте клеткам прилипнуть при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут.

После того, как клетки прикрепились к поверхности и распространились по ней, они готовы к фотоактивации и визуализации. Для получения изображений используйте флуоресцентный микроскоп с инвертированным полным внутренним отражением, оснащенный УФ-совместимым объективом со 150-кратным увеличением. Мониторинг зондов в зеленом и красном каналах с помощью лазеров возбуждения 488 нм и 561 нм соответственно.

После установки предметного стекла камеры, содержащей Т-клетки, отрегулируйте настройки микроскопа для получения TIRF или эпифлуоресцентного освещения, если это необходимо. В режиме «Живой» выберите поле ячеек, которые выражают интересующие флуоресцентные зонды. Создание областей микронного масштаба для фотоактивации под отдельными клетками с помощью программного управления.

Затем приступайте к приобретению. Как правило, требуется 80 временных точек с интервалом в пять секунд между каждым. Это оставляет время для последовательного воздействия на 488 и 563 нм в случае экспериментов с двойным цветом.

Затем, после получения 10 временных точек, фотоактивируйте выбранные области, открыв затвор цифровой диафрагмы на срок от одной до 1,5 секунды. После завершения таймлапса выберите новое поле ячеек и повторите процесс. Начните с определения интенсивности флуоресценции фоновой области за пределами клетки, которая будет использоваться для коррекции фона.

Нарисуйте квадратную область размером в микрон за пределами клетки и сделайте маску. Чтобы определить интенсивность флуоресценции, нажмите на Анализ, Маскировать статистику. Выберите Средняя интенсивность флуоресценции и экспортируйте значения.

Определите интенсивность флуоресценции в фотоактивированной области для каждой временной точки. Выберите «Маска», чтобы выделить область, которая была фотоактивирована. Чтобы определить интенсивность флуоресценции, нажмите на Анализ, Маскировать статистику.

Выберите Средняя интенсивность флуоресценции и Экспорт значений. Получите координаты X и Y центра фотоактивированной области, выбрав опцию Маска, чтобы выделить область, которая была фотоактивирована. После того как область фотоактивации будет выделена, выберите «Анализ», «Маскировать статистику», «Центр области» и «Экспортировать значения».

Определите координаты X и Y интересующего флуоресцентного зонда. Выберите «Ручное отслеживание частиц» и нажмите на интересующий флуоресцентный зонд с течением времени. После того, как все временные точки будут отслежены, выберите «Анализ», «Маскировать статистику», «Центр области» и «Экспортировать значения».

Т-клетки прикрепляли к камерному покровному стеклу, содержащему фотоактивируемый MCC-IEFK. C1-GFP, зонд для липидного второго мессенджера DAG, был визуализирован с помощью микроскопии TIRF и RFP-тубулина в режиме эпифлуоресценции. Локализованная фотоактивация поверхности под Т-клеткой индуцирует накопление DAG в зоне облучения.

За этим в течение нескольких секунд следует переориентация центросомы в ту же область. Накопление C1-GFP может быть количественно определено путем вычисления нормализованной интенсивности флуоресценции после коррекции фона в центре фотоактивированной области с течением времени. Переориентация центросом в ответ на фотоактивацию может быть количественно определена путем вычисления расстояния между центросомой и центром фотоактивированной области в зависимости от времени.

После освоения этой техники ее можно выполнить менее чем за сутки, если она выполнена правильно. Обычно за это время мы создаем от 15 до 20 видеороликов для анализа. Этот подход проложил путь для исследователей к изучению точной кинетики и поляризации активации сигнализации в Т-клетках.

Он также был адаптирован для изучения ингибиторной передачи сигналов в естественных клетках-киллерах. В результате теперь у нас есть лучшее понимание того, как собираются и растворяются коммуникативные взаимодействия между клетками иммунной клетки.