Одновременная различия моновидовые и смешанные DFS70 моделей во время Ана скрининга с подложке Роман HEp-2 Knockout элита/DFS70

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать улучшенный непрямой иммунофлуоресцентный анализ, в котором используется новый HEp-2, плотный мелкозернистый нокаутный субстрат 70 для скрининга антинуклеарных аутоантител и одновременного подтверждения моноспецифических и смешанных плотных мелкокрапчатых 70 паттернов. В новом субстрате HEp-2 используется стандартная процедура непрямой иммунофлюоресценции и критерии интерпретации для скрининга клинически значимых антинуклеарных антител, которые также известны как ПНА. Основным преимуществом является возможность отличить плотный мелкокрапчатый рисунок 70 от ассоциированных с болезнью, однородных крапчатых или сложных смешанных узоров на этапе скрининга.

Демонстрировать процедуру будет София Баданин, техник из нашей лаборатории контроля качества. Для предметных стекол с подложкой используйте стеклянные стекла с 12 лунками на каждом предметном стекле, содержащие либо обычные ячейки HEp-2, либо смесь обычных и плотных мелкозернистых 70 нокаутных ячеек HEp-2. Перед добавлением образца дайте пакетам, содержащим предметные стекла подложки, уравновеситься до комнатной температуры для оптимальной производительности и предотвращения конденсации влаги на поверхности предметного стекла.

Это должно занять от 10 до 15 минут. После балансировки до комнатной температуры осторожно снимите предметные стекла подложки пальцами, избегая контакта между предметными стеклами и стенками пакета. Пометьте предметные стекла и поместите их в инкубационную камеру, которая была выстлана смоченными бумажными полотенцами, чтобы предотвратить высыхание предметных стекол во время инкубации образца и сопряжения.

Диспонируйте примерно 50 микролитров отрицательного и положительного контроля, а также разведенную сыворотку пациента на отдельные лунки перед помещением предметных стекол в инкубационную камеру. Тест АНА является первым шагом в скрининге аутоиммунного заболевания. Крайне важно избегать перекрестного загрязнения образцов пациента на предметном стекле, чтобы свести к минимуму ложноположительные или ложноотрицательные результаты.

Чтобы предотвратить перекрестное загрязнение скважин, избегайте переполнения скважин. Накройте инкубационную камеру крышкой и инкубируйте предметные стекла в течение 30 минут при комнатной температуре. Если в сыворотке крови пациента присутствует какой-либо АНА, он будет связываться с клетками, присутствующими в каждом воле, в течение этого времени.

По окончании инкубационного периода извлеките предметное стекло из инкубационной камеры. Держите предметное стекло за конец язычка и аккуратно прополощите в течение 10-15 секунд примерно 10 миллилитрами восстановленного буфера для промывки, буферизованного фосфатами. Немедленно переложите предметное стекло в банку Coplin с буфером для промывки PBS и замочите на 10 минут.

Повторите процесс со всеми оставшимися слайдами. Вынимайте из банки Coplin только по одному предметному стеклу. Чтобы удалить излишки буфера для стирки PBS со предметного стекла, аккуратно постучите или промокните предметное стекло на бумажном полотенце.

На каждую лунку аккуратно нанесите по одной капле флуоресцеина изотиоцианата, меченного флуоресцентным конъюгатом против человека IgG. Затем инкубируйте предметные стекла в закрытой инкубационной камере окрашивания в течение 30 минут. По окончании инкубационного периода извлеките предметное стекло из инкубационной камеры.

Держите предметное стекло за выступ и аккуратно промойте, как и раньше, примерно 10 миллилитрами буфера для стирки PBS. Немедленно переложите предметное стекло в банку Coplin с буфером для промывки PBS и замочите на 10 минут. Положите чехлы-чехлы, которые есть в комплекте, на сухое бумажное полотенце.

На нижний край защитного накладки нанесите от 3 до 4 капель монтажного материала в линию. Затем выньте по одному предметному стеклу из банки Coplin, содержащей буфер для промывки. Чтобы удалить излишки буфера для стирки, аккуратно постучите или промокните предметное стекло по бумажному полотенцу.

Не оставляйте на затворе избыточное количество буфера для стирки, не оказывайте слишком большого давления на защитное стекло и не допускайте образования пузырьков воздуха. Все это может влиять на морфологию клеток, результирующие флуоресцентные паттерны и интенсивность реакций. Аккуратно опустите ползунок на защитное стекло, поместив нижний край предметного стекла к краю защитного стекла.

Это позволяет монтажному материалу, присутствующему на защитном стекле, стекать к верхнему краю предметного стекла и сводит к минимуму образование пузырьков воздуха, которые могут мешать считыванию показаний в каждой лунке. Просмотрите слайды с помощью флуоресцентного микроскопа, используя набор фильтра флуоресцеина изотиоцианата, расположенный в темной комнате. Исследуйте образец на удельную ярко-зеленую флуоресценцию под микроскопом при увеличении в 200 раз или более, чтобы сделать окончательную интерпретацию в отношении положительности и рисунка.

Наблюдайте за положительным и отрицательным контролем. Положительный контроль будет отображать ярко-зеленую флуоресценцию в ядре. Отрицательный контроль не будет отображать специфическую зеленую флуоресценцию под флуоресцентным микроскопом.

Запишите положительный или отрицательный результат для каждой лунки и включите шаблон ANA для положительных случаев. Плотный, мелкокрапчатый 70-нокаутный субстрат HEp-2 сохраняет все основные ядерные и цитоплазматические структуры. Плотный мелкокрапчатый рисунок характеризуется наличием равномерно распределенного крапчатого окрашивания по всему межфазному ядру и хроматина в митотической фазе.

Наличие как обычных клеток HEp-2, экспрессирующих плотный мелкокрапчатый антиген 70, так и сконструированных клеток HEp-2, лишенных антигена, способствует точному различению плотного мелкозернистой структуры 70, сохраняя при этом все преимущества обычных субстратов HEp-2. Сыворотки, положительные на основные заболевания, ассоциированные с АНА, смешивали с плотной мелкодисперсной крапчатой сывороткой 70-го типа в равных пропорциях и тестировали как на обычных субстратах HEp-2, так и на плотных мелкозернистых субстратах HEp-2 с нокаутом 70. Здесь красными стрелками обозначены клетки в митотической фазе.

Желтые стрелки обозначают обычные ядра HEp-2, а синие стрелки указывают на сконструированные ядра HEp-2. Для всех изображенных комбинаций реакций плотная мелкозернистая подложка с нокаутом 70 показывает четкую разницу в интенсивности между немодифицированными и сконструированными клетками в одном и том же поле зрения. Это помогает различать моноспецифические и смешанные, плотные, мелкодисперсные, крапчатые 70 реакции.

Аутоантитела к ядерным и цитоплазматическим антигенам широко распространены при системных аутоиммунных заболеваниях. Сообщалось, что плотный мелкозернистый рисунок, возникающий в результате выработки аутоантител к DFS70, также известного как белок PSIP1, широко распространен среди здоровых популяций. Более того, эти аутоантитела к DFS70 встречаются как изолированно, так и с другими АНА, ассоциированными с заболеванием.

В связи с этим для клинических лабораторий крайне важно точно отличать эту закономерность от других закономерностей, связанных с заболеванием. Например, при смешанном однородном крапчатом рисунке, который связан с волчанкой, может быть неверно истолкован как рисунок DFS70, требующий проведения нескольких подтверждающих анализов. Метод непрямой иммунофлюоресценции с использованием субстратов HEp-2 считается золотым стандартом скрининга на ПНА.

Тем не менее, точность в значительной степени зависит от мастерства техника, тщательного выполнения отдельных шагов и точной интерпретации полученных узоров. С другой стороны, сравнительная оценка обычных нокаутных подложек HEp-2 и DFS70 демонстрирует полезность этой новой подложки для различения паттерна DFS70 с высокой степенью достоверности при скрининге на ПНА. Дальнейшая интерпретация как монопозитивных, так и смешанных паттернов DFS70 была относительно упрощена с использованием этого улучшенного субстрата HEp-2.

В новом субстрате используется стандартный протокол непрямой иммунофлюоресценции и установленные критерии интерпретации для всех клинически значимых паттернов АНА.