Поколение стандартизированных и воспроизводимые переднего мозга тип мозгового Organoids от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Общая цель этой процедуры заключается в получении высокостандартизированных и воспроизводимых органоидов переднего мозга из плюрипотентных стволовых клеток человека. Этот метод является мощным инструментом для моделирования механизмов новых разработок НТЗ. В частности, это может помочь решить ключевые вопросы, связанные с ранним корковым генезисом человека.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет стандартизированное и эффективное по времени создание кортикальной ткани человека с небольшими вариациями между отдельными органоидами и партиями органоидов. Органоидная технология может дать представление о развитии, структуре и функционировании человеческого мозга, особенно в тех аспектах, которые не встречаются в моделях мозга низших видов. Для получения агрегатов плюрипотентных стволовых клеток, когда культуры стволовых клеток достигают конфлюенции от 70 до 90%, добавьте 500 микролитров реагента для диссоциации клеток в одну лунку из шести культуральных планшетов для отделения клеток.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, которые адаптированы к условиям монослойной культуры, являются хорошим типом клеток для получения агрегатов, поскольку они менее подвержены стресс-индуцированной гибели клеток во время процедуры диссоциации и агрегации. Через пять-10 минут при температуре 37 градусов Цельсия осторожно постучите по пластине и используйте два миллилитра DMEM/F-12, чтобы промыть клетки со дна лунки. Полученную клеточную суспензию переложите в коническую пробирку объемом 15 миллилитров, и доведите объем клеточного раствора до 10 миллилитров с большим количеством среды DMEM/F-12.

После подсчета перенесите 4,5 умножить на 10 на треть клеток на совокупность плюрипотентных стволовых клеток в новую пробирку объемом 15 миллилитров и соберите клетки центрифугированием. Мы суспензируем гранулу в соответствующем объеме плюрипотентной среды стволовых клеток, дополненной 50 микромолярным ингибитором породы для достижения 4,5 умноженного на 10 до трети клеток на 150 микролитров средней концентрации. Затем добавьте 150 микролитров ячеек в отдельные лунки 96-луночной U-образной нижней пластины с низким креплением и поместите пластину в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом.

Для мониторинга индукции передней нейроэктодермы используйте микроскоп тканевой культуры, чтобы внимательно наблюдать за морфологическими изменениями агрегатов плюрипотентных стволовых клеток каждый день при малом увеличении. В первый день следует наблюдать агрегаты клеток с четкими границами. На второй день осторожно отсасывайте примерно две трети среды, не нарушая клеточные агрегаты на дне каждой лунки, и замените выброшенную среду 100 микролитрами свежей плюрипотентной среды стволовых клеток.

Через четыре-шесть дней, когда клеточные агрегаты достигнут диаметра от 350 до 450 микрометров и обнаружат гладкие края, используйте модифицированный наконечник для пипетки объемом 100 микролитров, чтобы перенести до 20 агрегатов в одну шестисантиметровую культуральную пластину с низким уровнем прикрепления, содержащую пять миллилитров кортикальной индукционной среды. Заменяйте кортикальную индукционную среду свежей средой один раз в три дня, ежедневно контролируя морфологию агрегатов в соответствии с целью 4X. После четырех-пяти дней пребывания в корковой индукционной среде края клеточных агрегатов должны начать светлеть на поверхности, что указывает на нейроэктодермальную дифференцировку и радиальную организацию псевдослоистого эпителия.

Для встраивания нейроэктодермальных агрегатов в матричный каркас размораживают экстракт базальной мембраны на льду в течение двух-трех часов. Пока экстракт оттаивает, с помощью стерильных ножниц разрежьте пластиковую парафиновую пленку на квадрат четыре на четыре сантиметра на 16 органоидов и поместите каждый кусок пленки на пустой лоток для микропипеток объемом 100 микролитров. Прижмите парафиновую пленку кончиком пальца в перчатке, чтобы появились небольшие ямочки, и очистите пленку 70% этанолом.

После УФ-излучения в закрытом, стерильном шкафу биобезопасности в течение 30 минут используйте модифицированный наконечник для пипетки объемом 100 мкл с отверстием в полтора-два миллиметра для переноса каждого клеточного агрегата в одну ямочку в пленке. Когда все агрегаты будут перенесены, используйте неразрезанный наконечник пипетки объемом 100 микролитров, чтобы осторожно отсадить среду из каждой ямочки, и добавьте 40 микролитров неразбавленного экстракта базальной мембраны к каждому клеточному агрегату. Будьте осторожны, чтобы не повредить органоиды грубыми манипуляциями или аспирацией в наконечник пипетки, так как это может повредить развивающийся нейроэпителий.

С помощью наконечника пипетки расположите агрегаты в середине каждой капли, а с помощью стерильных щипцов аккуратно перенесите лист пластиковой парафиновой пленки в чашку Петри диаметром 10 сантиметров. Поместите блюдо в инкубатор на 15 – 20 минут. Пока экстракт застывает, добавьте пять миллиметров свежей среды для индукции коры головного мозга в одну шестисантиметровую чашку для культуры с низким уровнем прикрепления.

В конце инкубации переверните лист парафиновой пленки и с помощью стерильных щипцов аккуратно выдавите до 16 полимеризованных капель в каждую шестисантиметровую чашку. Затем агрегаты возвращают в инкубатор для клеточных культур. На следующий день перенесите чашки для органоидных культур в качающийся шейкер для клеточных культур, наклоненный под углом пять градусов при 14 оборотах в минуту в инкубаторе для клеточных культур, с ежедневным мониторингом световой микроскопии, пока агрегаты не достигнут интересующей стадии дифференцировки.

На 20-й день используйте модифицированный наконечник для пипетки объемом один миллилитр с отверстием на три-три с половиной миллилитра, чтобы собрать шесть органоидов из совокупных культур. Поместите три органоида в одну лунку 24-луночного планшета, содержащего 500 микролитров PBS, и используйте пятимиллилитровую пипетку, чтобы промыть органоиды два раза 500 микролитрами свежего PBS на одну промывку. После второй промывки зафиксируйте органоиды в холодном 4% параформальдегиде на 15 минут, затем три 10-минутные промывки при комнатной температуре PBS и окончательное ночное обезвоживание в 30% растворе сахарозы при четырех градусах Цельсия.

На следующий день предварительно окрашивайте обезвоженные органоиды в разведении от 1 до 50 Trypan Blue на 10 минут, чтобы обеспечить визуализацию органоидов во время процедуры криосекции, и замените сахарозу свежеприготовленной средой для заделки. Нагрейте пластину на грелке с температурой 60 градусов Цельсия в течение 15 минут, чтобы уравновесить органоиды в закладной среде, и накройте дно одной закладочной формы для каждого органоида свежей закладочной средой. Поместите форму на лед, чтобы затвердеть закладная среда, перенесите органоиды в закладные формы и добавьте свежую закладную среду, пока каждый органоид не будет покрыт.

Затем шоковой заморозкой органоидов в ванне для замораживания сухим льдом из 100% этанола в течение не менее одной минуты и с помощью криостата получить срезы каждого органоида толщиной 20 микрометров для иммуноцитохимического анализа. Для получения органоидов переднего мозга используйте только IPSC-культуры, которые представлены в виде однородного монослоя недифференцированных клеток в исходной популяции. На второй день агрегаты должны образовать компактные ячеистые почки с гладкими краями.

Агрегаты 10-го дня должны иметь гладкую и оптически гладкую и оптически прозрачную ткань на внешней поверхности, представляющую индукцию нейроэктодермы. При тщательном соблюдении протокола будут получены высокостандартизированные партии органоидов, которые демонстрируют более или равную 90% гомогенности в формировании поляризованной нейроэктодермы внутри и между партиями. Иммуноцитохимический анализ органоидов 20-го дня выявил стратифицированные нейроэпителиальные петли, которые экспрессируют маркер нейральных стволовых клеток Sox2, маркеры переднего мозга Pax6 и Otx2, а также дорсальный корковый маркер Emx1.

Эти корковые петли также характеризуются апикальной локализацией N-кадгерина и ZO-1, микротрубочками, происходящими от радиальных глиальных клеток желудочковой зоны, которые простираются от апикальной до базальной стороны структур, и апикально расположенными делящимися клетками, которые окрашивают положительно на фосфорилированный виментин. Для анализа плоскости деления апикальных радиальных глиальных клеток двойным окрашиванием на виментин и Tpx2 можно использовать белок, ассоциированный с микротрубочками, который можно использовать для визуализации митотического веретена и апикальных процессов во время межкинетической миграции ядер. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как получить высокостандартизированные и однородные органоиды переднего мозга из плюрипотентных стволовых клеток человека.

Этот метод облегчает изучение специфических для человека аспектов нарушений развития нервной системы с использованием сложной трехмерной модели клетки, организованной нейротканеспецифичным образом. Как только техника будет освоена, эти корковые органоиды могут быть использованы для различных приложений, таких как исследования нейроразвития, эволюции или функции генов, включая моделирование заболеваний и, возможно, тестирование лекарств или терапию.