Изготовление процедуры и двулучепреломления измерения для проектирования магнитно реагировать лантаноиды Ион Хелатирующие фосфолипидного сборок

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы получить высокочувствительные к магнитному отношению полимолекулярные ансамбли к хелатированию ионов лантаноидов, а также легко контролировать магнитную реакцию с помощью измерений двойного лучепреломления. Измерения двойного лучепреломления могут помочь ответить на ключевые вопросы в проектировании магнитно-чувствительных полимолекулярных сборок, таких как бицеллы, предоставляя альтернативные и сравнительно простые средства контроля выравнивания. Основным преимуществом этих полимолекулярных сборок является способность обеспечивать неуточненный и настраиваемый магнитный отклик при напряженности поля всего в один или два тесла за счет ассоциации с числами на ионы магнитного лантаноида.

Несмотря на то, что мониторинг искателя двулучепреломления дает важную информацию для проектирования бицеллей, он также может быть применен для изучения других магнитно-чувствительных систем, таких как нейрокристаллические седолы или амилоидные волокна, легированные наночастицами оксида железа. Чтобы начать процедуру, используйте стеклянный шприц объемом 2,5 миллилитра и три миллилитровых флакона с защелкивающимися крышками, чтобы измерить необходимое количество исходных растворов DMPC, DMPE-DTPA, холестерина и хлорида тулия (III). Соедините стоковые растворы в колбе с круглым дном объемом 25 миллилитров.

Промойте каждый флакон в колбе с 2,5 миллилитрами растворителя, используемого в соответствующем исходном растворе. Зажмите колбу на роторном испарителе. Удалите растворитель из смеси при температуре 40 градусов Цельсия ниже 30 000 Паскалей, пока не останется только вязкая прозрачная пленка.

Уменьшите давление до 100 Паскалей и продолжайте отбирать образец в течение как минимум двух часов, чтобы получить сухую липидную пленку. Затем промойте колбу с аргоном в течение одной минуты. Запечатайте колбу парафиновой пленкой и храните образец при температуре 18 градусов Цельсия.

Когда липиды будут готовы к регидратации, добавьте в колбу три миллилитра 15 миллимолярного фосфатного буфера с pH 7,4. Вращайте колбу в ванне с жидким азотом до тех пор, пока образец полностью не замерзнет, о чем свидетельствует то, что жидкий азот больше не кипит. Затем вращайте колбу в течение 5 минут на водяной бане, установленной на 60 градусов Цельсия.

Как только образец станет полностью жидким, сделайте его вихревым в течение 30 секунд. После последнего этапа заморозки стабилизируйте образец с помощью двух циклов нагрева-охлаждения. Во-первых, приобретите мембранные фильтры из поликарбоната с трековым травлением и желаемым размером пор для экструзии.

Начните сборку липидного экструдера объемом 10 миллилитров с сосудом для образцов с оболочкой, с помощью пинцета с силиконовым наконечником. Используйте несколько капель фосфатного буфера для увлажнения опорной сетки и дренажного диска из полиэстера для оптимального размещения мембранного фильтра. Аккуратно положите уплотнительное кольцо на мембранный фильтр.

Следите за тем, чтобы на мембране не было складок или заломов. Завершите сборку липидного экструдера и подсоедините сосуд для образцов с рубашкой к циркуляционному насосу воды с регулируемой температурой. Нагрейте водяную баню циркуляционного насоса до 60 градусов Цельсия и начните циркуляцию.

Подсоедините экструдер к баллону с газообразным азотом под давлением с помощью трубки высокого давления из ПВХ и быстроразъемных фитингов. Установите давление экструзии на значение, соответствующее размеру пор мембраны. Используйте стеклянную пипетку объемом два миллилитра, чтобы добавить образец в сосуд с оболочкой.

Закройте сосуд и дайте образцу сбалансироваться в течение 30–60 секунд. Поместите конец выходной трубки для образца в колбу для образцов. Затем откройте поток азота к экструдеру, удерживая выходную трубку для образца неподвижно.

После завершения экструзии образца выпустите вентиляцию из экструдера и используйте ту же стеклянную пипетку объемом два миллилитра, чтобы перенести экструдированный образец в сосуд с рубашкой. Выполните таким образом 10 циклов экструзии. Замена мембранного фильтра всякий раз, когда он начинает засоряться.

Повторите экструзию через поры меньшего размера по желанию. Включите и настройте прибор для измерения двулучепреломления. Затем поместите образец в кварцевую кювету с регулируемой температурой и длиной пути 10 миллиметров.

Подключите кювету к внешней водяной бане, установленной на пять градусов Цельсия. Вставьте в образец термопару K-типа толщиной 0,5 мм через отверстие в крышке. Отрегулируйте температуру водяной бани в зависимости от показаний термопары, пока образец не достигнет пяти градусов Цельсия.

Поместите кювету в отверстие магнита. Убедитесь, что термопара не находится на пути лазера, удерживая лист бумаги в траектории лазера за кюветой и ища тени, отбрасываемые термопарой. Важно контролировать температуру образца напрямую, но зонд не должен находиться на пути лазерного излучения.

Это легко проверить с помощью белой бумаги, помещенной в траекторию лазера после кюветы и поиска теней. Подавайте на кювету постоянный поток сухого сжатого воздуха комнатной температуры со скоростью 10 000 Па, чтобы избежать образования конденсата. Выберите множители чувствительности усилителя, следя за тем, чтобы усилитель не был перегружен, а на дисплее появлялось не более четырех красных полосок.

Далее выполните автофазу обоих синхронных усилителей. Мутность образца может резко меняться в течение температурного цикла из-за полимолекулярных перестроек. Самая высокая мутность обычно возникает при низких температурах, и чтобы избежать перегрузки сигнала при нагревании, чувствительность не следует устанавливать слишком высокой на уровне пяти градусов Цельсия.

Введите название образца и чувствительность синхронизированного усилителя. Введите имя файла для измерения и начните регистрировать данные. Затем увеличьте магнитное поле до 5,5 Тесла с помощью измерительной программы.

Получение данных о сигнале двойного лучепреломления при различных температурах образца и напряженности магнитного поля по желанию. Сигнал двулучепреломления бицеллей, легированных холестерином, выдавленных через мембраны с порами 800 нанометров, увеличивался с увеличением напряженности магнитного поля, при этом пиковая двулучепреломляемость достигалась на уровне 5,5 Тесла. Последовательная экструзия при 60 градусах Цельсия через мембраны с уменьшающимися размерами пор привела к снижению значений двойного лучепреломления при пяти градусах Цельсия.

Также наблюдалось снижение абсолютного коэффициента выравнивания. Эти результаты показали, что магнитное выравнивание может быть настроено путем регулировки размеров бицелла путем экструзии их предшественников везикул. После освоения этого метода его можно использовать ежедневно, чтобы эффективно проверять множество образцов и выявлять наиболее перспективных кандидатов, обеспечивая оптимальные магнитные связи в требуемом диапазоне температур.

После успешной идентификации наиболее перспективного образца с помощью этой процедуры могут быть выполнены такие методы, как малоугловое рассеяние нейтронов или криопросвечивающая электронная микроскопия, чтобы ответить на дополнительные вопросы о структуре физико-химических свойств сборок. При работе с липидными сборками, такими как представленные здесь бицеллы, важно работать с чистой стеклянной посудой в спокойной обстановке. Мы рекомендуем выделить для этой работы стеклянную посуду и мыть ее хлороформом.