Подготовка, очистка и характеристика комплексов лантанидов для использования в качестве контрастных агентов для магнитно-резонансная томография

Общая цель этой процедуры заключается в синтезе, очистке и определении характеристик лантаноидсодержащих комплексов, которые могут быть использованы для маркировки биологических макромолекул. Это достигается путем предварительного смешивания металлического исходного материала и лиганда при одновременном контроле pH раствора. Вторым этапом процедуры является очищение полученного комплекса с помощью диализа.

Далее необходимо проверить отсутствие свободного металла. Заключительным этапом процедуры является характеристика свойств комплекса, которые имеют отношение к визуализации. В конечном счете, можно получить результаты, которые показывают, что синтезированные комплексы будут вести себя как контрастные вещества при измерении активности расслабления.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области визуализации, например, изменяется ли координационное число воды контрастного вещества при связывании с белком. Как правило, люди, нуждающиеся в этом методе, будут испытывать трудности, потому что тщательный контроль pH приведет к тому, что LI станет бесполезным для биологического образования. Результаты диализа и измерения активности будут продемонстрированы в Буде и Саши.

Аспиранты из моей лаборатории: Чтобы начать измерение, с использованием солей лантаноидов сначала растворяют один эквивалент лиганда в воде, чтобы получить раствор с концентрацией от 30 до 265 миллимоляров. Здесь используется лиганд Paraiso Benzyl DTPA в концентрации 73 миллимоляра. Затем отрегулируйте pH раствора лиганда в диапазоне от 5,5 до 7, добавив один молярный гидроксид аммония.

В этом видео 0,2 миллилитра из одного молярного раствора гидроксида аммония теперь растворяют от одного до двух эквивалентов лантаноида хлорида в воде для получения раствора с концентрацией от пяти до 1000 миллимоляров. Хлорид евробиума или хлорид гадолиния могут быть использованы в концентрации 111 миллимоляров. Часто избыток металла используется для доведения вентиляции до конца и, следовательно, для упрощения очистки.

Далее добавьте каждый раствор солей латана в приготовленный раствор лиганда при помешивании. Теперь отрегулируйте pH полученных реакционных смесей до 5,5-7, добавив 0,2 молярного гидроксида аммония. Здесь для корректировки раствора используется в общей сложности 0,5 миллилитра из 0,2 молярного раствора гидроксида аммония.

Если используемый лиганд содержит кислоточувствительные функциональные группы, отрегулируйте pH несколько раз на этом этапе. Обязательно соблюдайте осторожность при регулировке pH, потому что, если раствор станет слишком простым, любые чувствительные к основаниям функциональные группы, такие как изотиоцианат, станут непригодными для использования. Для конъюгации внимательно следите за реакцией с помощью измерения pH.

Реакция завершается, когда pH остается постоянным Для лигандов без чувствительных к основаниям функциональных групп также может быть полезно обследование, включающее повышение pH. Чтобы начать диализное обследование, определите подходящую длину диализной трубки для удержания объема образца плюс дополнительную длину для удержания дополнительных 10% объема образца. Затем следуйте рекомендациям производителя, чтобы обрезать трубку до этой длины.

В этом видео использовалась отсечная мембрана Далтона с молекулярной массой от 100 до 500, но при необходимости можно использовать трубки с более высокой молекулярной массой, если конъюгация выполняется перед измерением, если это уместно, исходя из рекомендаций производителя, замочите разрезанную диализную трубку и воду в течение 15 минут при температуре окружающей среды. Далее наполните резервуар для диализа водой, которая будет служить диализатом. Здесь используется мензурка объемом в один литр.

Объем диализата должен быть примерно в 100 раз больше объема образца. Теперь сложите один конец трубки дважды и закрепите сложенную часть зажимом для закрытия диализа. Оберните конец укупорки резинкой, чтобы она оставалась закрытой во время диализа.

Заранее подготовленную реакционную смесь профильтровать через фильтр 0,2 мкм. Затем загрузите фильтрат в открытый конец трубки. Будьте осторожны, чтобы не порвать трубку.

Обязательно оставьте достаточно места для головки, чтобы закрыть трубку. Оставшийся открытый конец трубки сложите в два раза, затем закрепите его крышкой и оберните крышку резинкой. Затем прикрепите стеклянный флакон с воздухом к зажиму на одном конце диализной трубки с помощью другой резиновой ленты.

Затем прикрепите флакон с песком к другому зажиму. Эти флаконы гарантируют, что трубка останется погруженной в диализат. Теперь поместите полную трубку в резервуар для диализа, содержащий диализат.

Перемешайте диализат с помощью магнитной мешалки на медленной скорости при температуре окружающей среды. Убедитесь, что скорость перемешивания остается низкой, а раствор — нет. Вихрь. Меняйте диалат три раза в течение дня.

В этом видео диалат меняется через 2,5, 6,5 и 11,5 часов. Дайте диализу продолжаться в течение ночи в общей сложности от 20 до 28 часов. После завершения диализа извлеките трубку из диалата и осторожно откройте одну крышку, чтобы удалить образец.

Трижды промойте диализную трубку водой и соедините промывки с образцом. Наконец, удалите воду из образца под пониженным давлением. Это достигается путем сублимационной сушки.

Образец замораживается, а затем помещается на аппарат для сублимационной сушки. Чтобы оценить наличие свободного металла в образце, сначала приготовьте ацетатный буфер, растворив 1,4 миллилитра уксусной кислоты в 400 миллилитрах воды, и отрегулируйте pH до 5,8 с помощью одного молярного гидроксида аммония, а затем добавьте воду для получения общего объема 500 миллилитров. Затем растворите по 0,3 миллиграмм каждого комплекса в 0,3 миллилитрах буфера.

Теперь приготовьте оранжевый индикатор xol, который должен быть 16 микромоль в буфере pH 5,8. Добавьте три миллилитра этого индикаторного раствора в ранее растворенные металлические комплексы. Определите наличие свободного металла путем наблюдения за изменением цвета индикатора с желтого на фиолетовый.

При желании количество свободного металла может быть количественно определено путем создания калибровочной кривой. Если свободный металл остается, образец должен быть дополнительно очищен с помощью диализа или высокоэффективной жидкостной хроматографии перед определением характеристик. Далее для определения координационного числа воды для образца опия готовят раствор примерно одного миллимольяра опийсодержащего комплекса в воде, а затем еще один раствор такой же концентрации в оксиде дейтерия.

Перед анализом раствор оксида дейтерия необходимо испарить и трижды растворить в оксиде дейтерия, чтобы удалить остатки воды, включить спектрофлуориметр, добавить водный раствор в чистую вету и поместить вету в спектрофлуориметр. Теперь выполните возбуждение и излучение, чтобы определить максимумы для каждого из них на приблизительно 395 нанометрах и 595 нанометрах соответственно. Затем проведите эксперимент по затуханию времени фосфоресценции, используя только что определенные длины волн возбуждения и излучения и отображаемые здесь параметры.

Повторите этот шаг с приготовленным раствором оксида дейтерия на основе только что полученных данных о затухании люминесценции, естественного логарифма зависимости интенсивности от времени. Наклон этих линий и есть скорость затухания. В этом видео Microsoft Excel 2007 использовался для создания графиков натуральных журналов на основе необработанных данных.

Используйте скорости распада в уравнении, разработанном Hors и его коллегами, показанном здесь. Если ваш лиганд содержит группы OH или NH, скоординированные с металлом, то уравнение необходимо изменить перед использованием. Чтобы сначала определить измерения относительности образца, выберите нужный режим приложения на анализаторе времени релаксации: T one или T two.

Здесь выбрана настройка T one. Затем подготовьте серию образцов, которые содержат различные концентрации лантаноидсодержащего комплекса в растворителе. Здесь в качестве растворителя используется вода и растворы десяти пяти двух 0,5, 1,25, 0,625 и нуля.

Подготавливаются миллимоляры. Можно использовать и другие растворители или буферы, но важно использовать растворитель в качестве заготовки. Окончательный объем образца зависит от используемого инструмента.

Поместите образец в прибор и дайте ему постоять пять минут, чтобы он уравновесился до температуры прибора, которая составляет 37 градусов Цельсия для устройства, используемого в этом видео. Теперь определите время релаксации в секундах, настроив параметры программного обеспечения для получения гладкой экспоненциальной кривой для T one или T two. Повторите это для всех образцов, включая пустой.

Теперь рассчитайте обратное измеренным значениям релаксации T one или T two и построите график. Эти значения в зависимости от концентрации Латана и миллимолярных единиц укладываются в график прямой линией. Наклон подогнанной линии - это упражнение для расслабления, это R один или R два для T один и T два соответственно.

Здесь мы видим общую схему посредничества и очищения. На этой схеме изображена общая процедура лечения и причины выбора различных корней очистки. Здесь мы видим репрезентативный график затухания люминесценции, на котором естественный логарифм распада строится в зависимости от времени; наклоны линий, образованных из аналогичных кривых, необходимых для растворов воды и оксида дейтерия, используются с уравнением 1 для определения координационного числа воды комплексов, содержащих опий.

Здесь можно увидеть репрезентативный пример измерений левизны, где наклон аппроксимированной линии является T one livity образца. В дополнение к описанным в протоколе координационному числу воды и характеристике широты, также важно охарактеризовать конечные продукты с использованием стандартных химических методов. Идентичность соединения может быть получена с помощью масс-спектрометрии, показывающей диагностические изотопные структуры для гадолиний- и опиумсодержащих комплексов.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как эндр спектроскопия, ВЭЖХ и элементный анализ, для дальнейшей характеристики полученных комплексов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как синтезировать, очищать и характеризовать лантаноидсодержащие комплексы, которые можно использовать для маркировки биологических макромолекул.