Оценка цитотоксических и иммуномодулирующих эффектов веществ в легкое человека точности cut ломтики

Общая цель этой трехмерной модели прецизионно вырезанных ломтиков легких человека заключается в оценке цитотоксичности и иммуномодулирующих эффектов в модели ex vivo с использованием тканей человека. Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области фармакологии и токсикологии с целью оценки безопасности и помогают оценить физиологическую реакцию на вещества в естественной среде обитания человека. Основное преимущество этой методики заключается в том, что мы можем имитировать респираторные заболевания человека с точки зрения цитотоксичности или иммуномодулирующих эффектов, благодаря использованию свежих, жизнеспособных тканей человека.

Хотя этот метод может дать представление о межклеточных взаимодействиях человека, физиологии и патомеханизме при респираторных заболеваниях, он также может быть использован для других целей, а также для других видов. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности с организацией оценки человеческих тканей и созданием надежной инфраструктуры. Кроме того, процесс наполнения требует большой подготовки и опыта, из-за неоднородности легких.

Чтобы начать эту процедуру, канюлируйте трахею, вставив силиконовую трубку и зафиксировав ее зажимом параллельно трубке так, чтобы зажим сжимал ткань вместе с силиконовой трубкой, не защемляя ее. Закройте все остальные бронхи, кровеносные сосуды и травмы зажимами, чтобы агароза не могла вытекать во время процедуры наполнения. Хорошие анатомические навыки нужны для канюлирования главного бронха.

Легкие не должны быть расширены слишком сильно, иначе ткань будет отвлекать, и если ткань не будет заполнена достаточно, будет невозможно сделать какие-либо PCLS, потому что ткань слишком мягкая. Затем смешайте эквивалентный объем 3% низкожелирующей агарозы с питательной средой в стакане. Закапывают смесь в легкое с помощью шприца объемом 15 миллилитров.

Перед тем, как наполнить шприц медиумом, зажим закройте катетер пальцами или зажимом, чтобы избежать образования пузырьков воздуха и агарозного рефлюкса. Разрежьте легочную ткань на три-пять сантиметровых плит. Наполните тканевый слайсер 400 миллилитрами ледяного EBSS.

Сразу же вырежьте цилиндрические тканевые ядра из легочных плит, используя полуавтоматическую отвертку с инструментом для отбора керна. После этого переложите ядра тканей в держатель для салфеток слайсера. Поместите груз на верхнюю часть тканевого ядра и начните нарезать тканевое ядро на PCLS.

Среду следует слить из тканевого слайсера в стакан, открыв зажим стеклянного цилиндра. Далее переложите ломтики из стакана в чашку Петри с питательной средой. После этого поместите чашку Петри в инкубатор и дайте среде нагреться перед этапами мытья.

Затем осторожно переложите срезы легких в 24-луночный культуральный планшет с минимальным содержанием 500 микролитров питательной среды для двух срезов на лунку. Для приготовления мастер-смеси рабочего раствора разведите на каждую лунку 25 микролитров Реагента WST-1 и 225 микролитров среды. Далее пипеткой пипетируют по 250 микролитров мастер-смеси рабочего раствора WST-1 на каждую лунку и инкубируют пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа.

Убедитесь, что PCLS полностью покрыты реагентом WST-1 во время инкубации. После этого поместите планшет на орбитальный шейкер с частотой вращения 200 об/мин и осторожно встряхивайте в течение 30 секунд, чтобы обеспечить тщательное смешивание реагента WST-1. Затем пипетируйте 100 микролитров надосадочной жидкости из каждой лунки 24-луночного планшета на новый 96-луночный планшет с плоским дном в двух экземплярах.

Измерьте поглощение каждой лунки на глубине 450 нанометров с помощью считывателя микропланшетов и вычтите поглощение на глубине 630 нанометров из эталонной величины на глубине 450 нанометров. После инкубации PCLS с тест-агентами или без них перенесите 50 микролитров надосадочной жидкости в двух экземплярах в новую 96-луночную пластину. При этом создаются дубликаты из каждой обработанной лунки 24-луночного планшета.

Непосредственно перед проведением анализа приготовьте мастер-смесь рабочего раствора агента без ЛДГ, тщательно перемешав 125 микролитров раствора катализатора с 6,25 миллилитрами раствора красителя для 96-луночного планшета. Затем пипеткой внесите 50 микролитров мастер-микса рабочего раствора в каждую лунку, уже содержащую 50 микролитров надосадочной жидкости. Выдержите тарелку в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте.

После этого измерьте поглощение каждой лунки на 492 нанометра с помощью считывателя микропланшетов и вычтите поглощение на 630 нанометрах от поглощения на 492 нанометрах. Для микроскопической оценки выполните по крайней мере два случайно распределенных Z-стека с помощью cLSM. Нажмите на вкладку «Окуляр», чтобы выбрать 10-кратный объектив.

Нажмите «Онлайн», чтобы использовать cLSM в качестве стандартного светового микроскопа для поиска поверхности PCLS. Затем нажмите «Автономно», чтобы выйти из настройки окуляра. Затем перейдите на вкладку «Получение» и включите соответствующие лазеры для флуорофоров.

Нажмите «Световой путь» на вкладке «Получение» и настройте необходимые фильтры и зеркала для эксперимента. Нажмите кнопку в реальном времени, чтобы увидеть соответствующий слой на экране в режиме реального времени. Перемещайте фокус вверх или вниз, чтобы найти поверхность PCLS с помощью четкого сигнала.

Затем установите отверстие для канала гомодимера-1 красного этидия на одну воздушную единицу для наилучшего соотношения между эффективностью сбора света и оптическим сечением и соответствующим образом отрегулируйте канал кальцеина. Увеличить обнаруженный сигнал усиления. Увеличьте или уменьшите цифровое смещение, чтобы настроить фон таким образом, чтобы он отображался синим цветом на живом изображении с активированной таблицей блокировки цвета канала.

Установите флажок Z-stacks, чтобы установить верхний и нижний пределы микроскопического объема. Медленно смещайте фокус вверх или вниз, пока не будет достигнут диапазон 30 микрометров, и нажмите Set Last для сохранения. Затем нажмите «В реальном времени» еще раз, чтобы деактивировать «Живое изображение», и нажмите «Начать эксперимент», чтобы начать создание образа.

Здесь представлены микроскопические изображения жизнеспособности PCLS, которые демонстрируют реакцию тканей человека на детергент как эффективное токсичное вещество. Токсические эффекты визуально оцениваются путем оценки кальцеин-положительной ткани по сравнению с ядрами клеток этдия-гомодимера-1. Несмотря на то, что жизнеспособность легочной ткани человека варьируется у разных доноров, количество ядер мертвых клеток по сравнению с жизнеспособной тканью не должно превышать 15% от тканевого контроля.

На этом рисунке представлены репрезентативные данные об иммуномодулирующем действии гексахлорплатината аммония, SLS, на легочную ткань человека. Внеклеточные и внутриклеточные IL-1 альфа и TNF-альфа определяли методом иммуноферментного анализа и нормализовали к общему содержанию белка. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области фармакологии и фундаментальной науки к изучению физиологических реакций в жизнеспособной ткани легких человека.

После этой процедуры могут быть выполнены другие конечные точки, такие как сужение дыхательных путей, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как эффективность бронходилататорного препарата. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее общее представление о том, как создавать и обрабатывать срезы легких человека с высокой точностью. После освоения этой техники ее можно выполнить в течение шести-восьми часов, а первые результаты будут доступны в течение первых 24 часов, если все выполнено правильно.

Однако не забывайте, что работа с человеческим незакрепленным материалом может быть очень заразной, и во время выполнения этой процедуры всегда следует носить меры предосторожности, такие как защитная одежда. Кроме того, важно помнить, что нужно работать в стерильных условиях, насколько это возможно.