Метод эффективного складывая и очистки Хеморецепция лигандом привязки домена

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы удалить хеморецепторный лиганд-связывающий домен из тел включения и очистить его для использования в структурных и функциональных исследованиях. Чтобы установить, какие сигналы посылает бактериальный хеморецептор и каким образом, можно использовать изолированные лиганд-связывающие домены для скрининга небольших молекулярных библиотек или для определения структуры с лигандом и без него. Подавление внеклеточного лиганд-связывающего домена в E.coli часто приводит к отложению в тельцах включения.

Здесь мы показываем, как миллиграммы функционального белка могут быть восстановлены из тел включения. Для начала инокулируйте 150 мл стерильного бульона LB, содержащего 50 мкг/мл ампициллина, клетками BL21-CodonPlus RIPL, трансформированными с помощью вектора pET151 D-TOPO для экспрессии гексахистидина TIp3-LBD. Инкубируйте культуру при 200 об/мин и 37 градусах Цельсия в течение ночи.

Приготовьте шесть 2-литровых колб Эрленмейера, содержащих 800 мл стерильного бульона LB и 50 мкг ампициллина на мл. Инокулируйте в каждую колбу 20 мл ночной культуры. Инкубируйте колбы при температуре 37 градусов Цельсия с непрерывным встряхиванием при 200 об/мин до тех пор, пока внешний диаметр 600 не достигнет 0,6.

На этом этапе индуцируйте экспрессию белка, добавив 1 миллимолярный IPTG в каждую колбу. Продолжайте инкубировать колбы при температуре 37 градусов Цельсия в шейкере со скоростью 200 об/мин в течение еще четырех часов. Соберите клетки центрифугированием при температуре 5000 xg и четырех градусах Цельсия в течение 15 минут.

Затем выбросьте надосадочную жидкость. Переложите все гранулы клеток в стакан объемом 250 мл и добавьте 100 мл буфера А. Если они заморожены, дайте клеткам полностью оттаять, а затем снова суспендируйте гранулу. Держите образец на льду, если не указано иное.

Затем трижды пропустите ресуспендированные клетки через гомогенизатор высокого давления, чтобы лизировать клетки и обеспечить полный сдвиг геномной ДНК. Затем центрифугируйте лизат при температуре 10 000 xg и четырех градусах Цельсия в течение 15 минут. Соберите образец надосадочной жидкости объемом одного мл и храните его при температуре минус 20 градусов Цельсия для последующего анализа SDS-PAGE.

Затем выбросьте остатки надосадочной жидкости и положите гранулу на лед. Далее тщательно суспендируйте гранулы тела включения в 20 мл ледяного буфера В. Это способствует солюбилизации мембраны и мембранных белков. Переведите образец на вортекс в течение одной-двух минут, чтобы помочь в ресуспендировании.

После центрифугирования образца снова тщательно суспендируйте гранулу в 20 мл ледяного буфера B, предварительно провергнув пробирку на одну-две минуты. Следите за тем, чтобы гранула была разбита на мелкие кусочки. Затем проводите пипеткой образец вверх и вниз, чтобы снова суспендировать его.

Центрифугируйте образец, как и раньше, и выбросьте надосадочную жидкость. Если надосадочная жидкость помутнела или окрашена, снова центрифугируйте образец и используйте дополнительный ледяной буфер B для его ресуспендирования. Повторите центрифугирование и повторную суспендию до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной и бесцветной, прежде чем снова гранулировать.

Добавьте 20 мл ледяного буфера C в гранулу и повторно суспендируйте ее, вортексируя трубку в течение одной-двух минут. Затем, после вращения образца, добавьте 25 мл ледяного денатурирующего буфера D. Тщательно суспендируйте тела включения гранулы, вортексируя трубку в течение одной-двух минут или до тех пор, пока гранула не разобьется на мелкие кусочки. Перемешивайте суспензию путем осевого вращения при 30 об/мин и 4 градусах Цельсия в течение 30-120 минут.

Осветите денатурированный белковый раствор центрифугированием при 30 000 xg и четырех градусах Цельсия в течение 30 минут. Затем поместите надосадочную жидкость на лед и выбросьте гранулы. При перемешивании 250 мл буфера Е при 500 об/мин добавьте 60 мг денатурированной белковой смеси, содержащей гексахистадин TIp3-LBD.

Инкубируйте смесь при температуре четыре градуса Цельсия при непрерывном перемешивании со скоростью 500 об/мин в течение 24–48 часов. Конечная концентрация белка составляет 0,2 мг на мл. После приготовления семи литров предварительно охлажденного буфера А и диализной трубки в соответствии с текстовым протоколом используйте закрытие диализной трубки для зажима одного конца диализной мембраны и переноса диализной смеси в трубку.

Затем зажмите открытый конец и убедитесь, что нет утечек. Поместите диализную трубку в ведро для диализа с предварительно охлажденным буфером A. Затем добавьте магнитную мешалку, следя за тем, чтобы она не касалась диализной трубки во время перемешивания. Диализуйте образец при температуре четыре градуса Цельсия при непрерывном перемешивании со скоростью 500 об/мин и меняйте буфер не менее четырех раз в течение 12 часов.

После последней замены буфера оставьте образец для диализа на ночь. На следующее утро извлеките диализную трубку из ведра и перелейте ее содержимое в стакан объемом 500 мл. Храните белковый раствор на льду, если не указано иное.

Отфильтруйте белковый раствор через мембрану размером с пор размером 0,43 микрона в стеклянную бутылку объемом 500 мл, чтобы удалить любой осажденный белок. После промывки, зарядки и уравновешивания хелатирующей колонки в соответствии с текстовым протоколом отрегулируйте полученный повторный образец белка до состава буфера F, добавив 25 мл 5 М натрия хлорида, 2,5 мл 1 М трис-HCl, pH 8,0 и 2,5 мл 2 М исходных растворов имидазола. Загрузите образец в колонку со скоростью 5 мл в минуту или менее и удалите проточный поток, содержащий несвязанные белки.

Затем промойте колонку 50-100 мл буфера F, чтобы удалить неспецифически связанные белки, и выбросьте проточный поток. Разбавьте гексахистадин TIp3-LBD 25 мл буфера G. Затем объедините проточные фракции, содержащие белок. После подготовки буфера H и диализной трубки в соответствии с текстовым протоколом добавьте меченую гексахистадином протеазу TEV к белку, меченному гексахистадином в трубке.

Добавьте итоговое молярное соотношение одного TEV к восьми белкам. Поместите зажатую диализную трубку в предварительно охлажденные четыре л буфера H и инкубируйте его при температуре четыре градуса Цельсия при непрерывном помешивании в течение двух часов. Затем смените буфер и продолжайте диализ в течение ночи, чтобы завершить TEV-опосредованную реакцию расщепления.

После замены в буфер I, фильтрации белкового раствора и повторной корректировки образца загрузите образец в подготовленную 5 мл хелатирующую колонку HiTrap HP. При расходе пять мл в минуту соберите проточный поток, который содержит немаркированный TIp3-LBD. На расщепленном белке расщепленная гексахистадиновая метка и гексахистадин TEV удерживаются колонкой.

Используйте пять мл буфера F, чтобы промыть колонку, чтобы позволить непомеченному белку протекать и собирать элюат. Затем, после уравновешивания колонки исключения размера и концентрирования и осветления образца белка в соответствии с текстовым протоколом, загрузите образец на предварительно уравновешенную гелевую фильтрационную колонку 26/60. Применяйте буфер А со скоростью потока четыре мл в минуту и контролируйте УФ-след для элюирования белка.

TIp3-LBD элюирует с объемом удержания от 210 до 220 мл. Наконец, после хроматографии объедините фракции, затем измерьте концентрацию белка и выполните SDS-PAGE. Процедура выделения белка, продемонстрированная в этом видео, дала от 10 до 20 мг чистого немеченного TIp3-LBD на один л бактериальной культуры.

Как видно на рисунке, белок, элюированный из гелевой фильтрационной колонки, имеет одиночный симметричный пик, соответствующий объему удержания 220 мл при расчетной молекулярной массе 29 кДа. Как показано на сайте SDS-PAGE, тела включения содержали преимущественно гексахистадин TIp3-LBD с видимой молекулярной массой 28 кДа, что близко к значению, рассчитанному по аминокислотной последовательности в 31,8 кДа. Этапы удаления гексахистадиновой метки, аффинной хроматографии и гелевой фильтрации позволили получить высокочистый белок.

Спектроскопия БК с использованием CDSSTR показала, что вторичная структура гексахистидина TIp3-LBD на 31% состоит из альфа-спирали и на 23% из бета-листа. Они также были близки к прогнозируемым значениям 37% и 26% соответственно при анализе последовательностей с использованием сервера JPred 3. Этот протокол требует минимум пяти дней от начала до конца и при необходимости может быть приостановлен на трех разных этапах.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что тщательная и полная ресуспендия включенных тел в денатурирующем буфере путем вихревого или пипетирования вверх и вниз имеет решающее значение для всей этой реализации. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как восстанавливать и очищать лигандсвязывающий домен хеморецептора TIp3. Очищенный белок может быть использован для связывания кислот с целью исследования специфичности лиганда к этому рецептору.

Кроме того, ранее мы показали, что белок, полученный с помощью этой процедуры, может быть использован для получения высокоупорядоченных кристаллов, что открыло путь к изучению структурных основ его лигандной специфичности. Эта процедура может быть в целом полезной для получения мг хеморецепторов из других бактерий в кристаллизуемой и растворимой форме. Мы использовали этот протокол в его исходном или слегка измененном виде для восстановления и очистки лигандсвязывающего домена других хеморецепторов этого типа для кристаллографических исследований.

Помните, что в каждом отдельном случае наверняка потребуется оптимизация протокола, например, состав денатурирующего и рефолдирующего буферов и время инкубации.