Разработка Microfluidic приборы для изучения удлинение возможности Tip выращивания растительных клеток в чрезвычайно малых пространств

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии растительных клеток, например, как растительные клетки, выращивающие верхушки, проникают через клеточные физические барьеры. Основным преимуществом этого метода является возможность получения изображений с высоким разрешением, что восстанавливает процесс деформации клетки в микрометровом масштабе под обычным микроскопом. Чтобы сделать прибор для исследования растущих пыльцевых трубок и мха протонематов, сначала изготовьте примерно 11 грамм PDMS, а затем загрузите его в четырехдюймовую форму.

Затем дегазируйте форму в течение 20 минут в вакуумной камере. Далее отверждайте плесень при температуре 65 градусов Цельсия в течение 90 минут. После отверждения снимите слой PDMS с формы и откройте отверстия для доступа к каналу внутри PDMS с помощью инструмента для пробивки биопсии.

Далее подвергните PDMS и пятисантиметровую стеклянную чашку воздействию воздушной плазмы в течение 50 секунд. Чтобы изолировать микрофлюидную сеть, прижмите слой PDMS к стеклянной чашке и отверждайте его в течение 30 минут при температуре 65 градусов Цельсия. Чтобы сделать микроустройство, предназначенное для исследования корневых волос, загружаются и отверждаются две формы.

При пробивке отверстий в каналах используйте двухмиллиметровый пробойник. После воздействия на оба слоя воздушной плазмы в течение 50 секунд соедините их вместе, включая покровное стекло, под стереомикроскопом. Для этого используйте специально изготовленный инструмент для выравнивания.

Отверждите узел в течение 30 минут в духовке, чтобы закрыть микрофлюидную сеть. После отверждения снимите покровное стекло с прибора, и переложите его в пятисантиметровую стеклянную посуду. Перед использованием микроприбора из пыльцевой трубки дегазируйте его в вакуумной камере в течение 20 минут.

Добавьте питательную среду на входное отверстие пестика с помощью микропипетки с тонким наконечником. Загрузите остальные лунки той же средой. Подождите несколько минут, чтобы каналы заполнились.

Тем временем положите в тарелку влажное бумажное полотенце, чтобы поддерживать местную влажность. Теперь соберите пыльцевые зерна с сине-белого цветка T.fournieri. Перенесите зерна на рыльце с помощью рассекающей иглы.

Далее разрежьте вдоль опыленный стиль длиной один сантиметр, а затем вставьте срез в входное отверстие микрофлюидного устройства. Когда срез вставляется во входное отверстие микрофлюидного устройства с помощью пинцета, важно не держать накладку очень крепко, так как это может повредить укладку. Затем закрепите чашку крышкой с помощью скотча и перенесите чашку в инкубатор при температуре 28 градусов Цельсия, где она должна оставаться в темноте в течение пяти-шести часов.

Работая под ламинарным колпаком, начните со стерилизации трансгенных семян A.thaliana Columbia. Замочите их в чистящем растворе на пять минут. Затем тщательно промойте семена в автоклавной воде.

После стерилизации храните семена при температуре четыре градуса Цельсия в темноте в течение 48 часов. Через несколько дней дегазируйте микроустройство в течение 20 минут перед его использованием. Далее загрузите соответствующую питательную среду в лунки прибора с помощью пипетки с тонким наконечником, и подождите несколько минут, пока раствор не протянется по всем каналам.

Кроме того, насыпьте на блюдо немного влажного бумажного полотенца для поддержания влажности. Теперь перелейте подготовленное зерно во входное отверстие устройства. Затем зафиксируйте крышку с помощью скотча и перенесите чашку в инкубатор с температурой 22 градуса Цельсия при постоянном освещении.

Перед его использованием простерилизуйте микроприбор под воздействием ультрафиолета в течение ночи. На следующий день дегазируйте микроустройство в течение 20 минут. После дегазации загрузите в микролунки соответствующую питательную среду.

Пока каналы постепенно заполняются, окружите микроустройство небольшим количеством автоклавной воды для поддержания влажности. Перенесите небольшой кусочек ткани протонематы мха к входу микроустройства. Теперь культивируйте устройство при температуре 25 градусов Цельсия под постоянным светом.

После двух-трех недель роста сделайте снимки результатов в светлом поле под микроскопом. Растительные клетки, растущие на верхушках, сталкиваются с рядом физических барьеров на путях роста in vivo, таких как в передающем тракте и на микропиле, не говоря уже о пути корневых волосков в почве. Представленные микрофлюидные платформы для культивирования клеток in vitro позволяют исследовать процесс выращивания верхушки в трех типах растительных клеток: пыльцевых трубках, корневых волосках и протонематах мха.

Просмотр осуществляется через зазоры в один микрон в приборах. Поскольку микрозазоры такого размера хрупкие, иногда они закрываются, особенно после многократного использования. Таким образом, перед проведением экспериментов важно убедиться в том, что зазоры не повреждены.

Для исследования пыльцевых трубок использовалась визуализация живых клеток для мониторинга морфологических изменений в апикальной области пыльцевых трубок, а также в вегетативном ядре и сперматозоидах в ответ на столкновение с чрезвычайно маленьким пространством. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биологии растительных клеток к изучению способности к удлинению растительных клеток, таких как пыльцевые трубки, корневые волоски и протонематы мха, в чрезвычайно маленьком пространстве.