Визуальные и микроскопических оценки Streptomyces развития мутантов

Общая цель следующих методик состоит в том, чтобы обучить начинающих исследователей работе со Streptomyces и другими родственными видами в университетской учебной лаборатории и в классах средней школы. Фенотипическое наблюдение важно для многих исследователей, вступающих в область изучения Streptomyces. В этом видео описаны методы размножения, хранения, а также визуального и микроскопического исследования бактерий.

Описанные здесь методы фенотпирования используют в качестве модели Streptomyces coelicolor. Тем не менее, методы применимы ко всем членам большого рода, а также к близкородственным Actinomyces. Основное преимущество этих методов заключается в том, что они разработаны таким образом, чтобы быть доступными как для начинающих исследователей в классе средней школы или учебной лаборатории бакалавриата, так и для опытного персонала лаборатории.

После просмотра этого видео и прочтения сопроводительного протокола новые исследователи смогут манипулировать своими штаммами Streptomyces, правильно хранить их и начинать эксперименты по визуальной характеристике. Демонстрировать процедуры будут Гаррет Канделл и Шон Кирк, студенты-исследователи из моей лаборатории в Университете Оттербейн. Для начала используйте стандартный метод, такой как метод квадрантной полосы, продемонстрированный в Saunders 2012, для разбивки штаммов Streptomyces на агаровых пластинах MS и культивирования в отдельные колонии.

Каждые четыре-шесть дней выбирайте одну колонию и перекладывайте ее на свежую тарелку. По мере старения колонии становятся склонными к случайным мутациям. После проведения мутагенеза в соответствии с текстовым протоколом обратите внимание на морфологию колонии для каждого мутанта по сравнению с родительским штаммом дикого типа.

При описании новых видов Streptomyces сравнивайте новый изолят с изолятом хорошо изученного вида, обращая внимание на основную форму, поверхность колонии, непрозрачность, высоту и пигментацию. Пометьте агаровую пластину MS и нанесите полосы дикого типа и мутантные штаммы клином. Будьте осторожны, чтобы ни один штамм не соприкасался с другим штаммом, чтобы избежать перекрестного загрязнения.

Обратите внимание на дату и время, когда штаммы нанесены на пластину. Затем инкубируйте пластины при температуре 30 градусов Цельсия. Помните, что чрезвычайно важно всегда защищать образец Streptomyces от загрязнения.

Используйте наилучшую стерильную технику для всех этапов, открывая планшеты и пробирки за минимально возможное время. Поместите выращенные чашки Петри на цветную или белую бумагу, чтобы гомогенизировать фон. Напишите на бумаге название сорта, дату, температуру инкубации и время с момента первой полосы на планшете.

Сделайте цифровые снимки пластины с информацией о деформации, написанной на бумажном фоне, чтобы свести к минимуму путаницу. Простерилизуйте пинцет, промыв его в 70% этаноле, а затем пропустив через пламя горелки Бунзена для испарения этанола. Простерилизуйте покровные листы, промыв их в 70% этаноле, а затем дайте им высохнуть в стерильной чашке Петри.

Затем, чтобы подготовить покровное стекло для снятия бактериального роста, используйте стерильный пинцет, чтобы взять стерильный покровный лист и поместить его на агаровую пластину MS, где рост бактерий плотный. С помощью пинцета аккуратно надавите на заднюю сторону покровного стекла, чтобы обеспечить достаточный перенос бактериальных спор и воздушного мицелия. Возьмите покровное стекло с пластины и поместите его под углом 45 градусов так, чтобы материал клетки был обращен к поверхности предметного стекла микроскопа, содержащего каплю 50% глицерина объемом 15 микролитров.

Дайте покровному стеколу упасть на глицерин, который уменьшит количество пузырьков воздуха. Для проведения фазово-контрастной микроскопии через различные промежутки времени поместите подготовленное предметное стекло на предметный столик микроскопа и добавьте каплю иммерсионного масла в центр покровного стекла. Поверните фазовый объектив в 100 раз на место и установите револьверную головку конденсатора на правильную правильную настройку фазы.

Когда линза объектива соприкоснется с маслом, для фокусировки изображения используйте только ручку точной регулировки. Изучите несколько полей зрения, чтобы различить заметные и последовательные различия между мутантными штаммами и диким типом. Например, способность образовывать споры, размер и форма спор, а также общее количество спор.

Используя стерильный пинцет, подготовьте покровный стеклоподъемник с агаровой пластины MS, как и раньше, где рост бактерий очевиден, осторожно коснувшись пинцетом обратной стороны покровного стекла, чтобы обеспечить достаточный перенос бактериальных спор и воздушных нитей. Снимите покровное стекло с пластины и положите его на картон так, чтобы сторона с материалом ячеек была обращена вверх для удобства и манипулирования покровным листом. Ледяным метанолом залейте покровную крышку и оставьте на пять минут.

С помощью PBS промойте покровное стекло два раза, аккуратно дозируя и удаляя раствор. Добавьте на предметное стекло 15 микролитров раствора йодида пропидиума с концентрацией 10 микрограмм на миллилитр и или 10 микрограммов на миллилитр WGA-FITC. Положите покровную крышку лицевой стороной вниз на каплю флуоресцентного морилки.

Инкубируйте образцы в затемненном или слабо освещенном помещении в течение 15 минут. Запасы флуоресцентных красителей и образцы пятен следует беречь от света. При подготовке образцов исследователям рекомендуется использовать условия низкой освещенности, а после подготовки образцов использовать темный ящик для хранения образцов.

Наблюдайте за предметными стеклами под объективом со 100-кратным увеличением с помощью фазово-контрастного микроскопа или микроскопа DIC, оснащенного кубами эпифлуоресцентного возбуждения для йодида пропидиума и FITC. Анализируйте изображения в соответствии с текстовым протоколом. Здесь показаны примеры мутантов Streptomyces, полученных в результате мутагенеза транспозонов.

Более светлый цвет воздушного мицелия может указывать на более низкий уровень серого пигмента, вызванный дефектом спороношения. Или отсутствие пушистого внешнего вида свидетельствует о блокировке образования воздушной мицелии. Как видно с помощью фазово-контрастной микроскопии, колонии дикого типа S.coelicolor обычно производят воздушный мицелий примерно через два дня роста.

И длинные цепочки спор к трем дням роста. Белые мутанты могут либо задерживаться для образования спор, либо демонстрировать уменьшение количества производимых спор, производить споры с дефектами формы и/или размера или просто производить более низкие уровни зрелого пигмента серых спор. Показано здесь с использованием ДВС-и флуоресцентной микроскопии с PI-окрашиванием, регулярное окрашивание цепочки спор в образце дикого типа сравнивается с прерывистым окрашиванием двух мутантов транспозонов, которые демонстрируют дефект сегрегации хромосом.

При использовании WGA-FITC для окрашивания клеточной стенки дикого типа штамм S.venezuelae присутствует в виде гладких воздушных нитей среди цепочек спор. И демонстрирует латеральный массив септ деления, которые обычно наблюдаются во время спороношения. Работа с нитчатым организмом сильно отличается от работы с хорошо известными палочковидными бактериями.

Видеопротоколы здесь должны послужить важным ресурсом для совершенно новых исследователей, вступающих в область исследования Streptomyces. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, с чего начать изучение видов Streptomyces и других родственных бактерий. После этих первоначальных экспериментов в исследовательской лаборатории можно использовать различные методы, чтобы узнать больше о штаммах Streptomyces.

Например, некоторые из передовых методов могут быть мечением белков или анализом экспрессии генов, таким как ПЦР в реальном времени и секвенирование РНК. Первоначальные эксперименты по фенотипированию используются для идентификации и характеристики новых штаммов и определения типичной роли конкретного гена. Эти методы уже использовались в университетских учебных лабораториях для идентификации и характеристики широкого спектра штаммов Streptomyces.