Высокая пропускная способность экспрессии белков генератора с использованием платформы Микрофлюидных

Общая цель этой процедуры заключается в создании модульного белкового массива, который не требует этапа очистки, что делает его совместимым с любой библиотекой белков. Это достигается путем создания синтетических генов с помощью сборочной ПЦР. Затем синтетические гены размещаются на предметных стеклах из эпоксидной смолы.

Для изготовления микрофлюидного устройства используют PDMS с силиконовыми контрольными и проточными формами. Затем микрофлюидное устройство выравнивается по пятнистой матрице ДНК. Наконец, лизат ретикулоцитов кролика подается в микрофлюидное устройство, и белки экспрессируются.

В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают экспрессию тысяч белков посредством флуоресцентного мечения антителами. Существует несколько преимуществ использования микрофлюидного метода по сравнению с существующими методами, такими как белковые микрочипы. Мы создаем микрочипы ДНК, а затем используем cellis для создания белков на устройстве.

Таким образом, мы не нуждаемся в очистке белка и белки никогда не высыхают. Они остаются свежими на протяжении всего эксперимента. Микрофлюидный метод также обеспечивает более высокую чувствительность Чтобы изготовить микрофлюидное устройство, подвергните силиконовый регулятор и пресс-формы воздействию паров хлортриметилсилена в течение 10 минут, чтобы стимулировать высвобождение эластомеров.

После этапов запекания приготовьте смесь эластомера на основе силикона и отвердителя в двух различных соотношении пять к одному и 20 к одному для контрольных и проточных форм соответственно. Вылейте PDMS пять к одному на контрольный слой. Дегазируйте контрольный слой и выпекайте его в течение 30 минут при температуре 80 градусов Цельсия.

Затем нанесите смесь PDMS 20 к одному на слой потока при 2, 600 об/мин в течение 60 секунд, а затем выпекайте при температуре 80 градусов Цельсия в течение 30 минут. Медленно отделите контрольный слой от формы, стараясь не отклеить выкройку SU eight. Затем с помощью скальпеля разрежьте устройство по его периметру и с помощью тупой иглы проделайте отверстия для доступа к каналам управления под микроскопом.

Вручную совместите проточный и контрольный слои, начиная с верхнего левого угла и расположив кнопочный клапан на слое управления в центре реакционной камеры. Далее, выровняйте первый ряд и аккуратно отпустите слой управления ряд за рядом. Убедитесь, что все кнопочные клапаны находятся в центре реакционных камер, а адресный и входной клапаны пересекают проточные каналы в правильном положении.

Повторяйте процесс локально, пока все строки не будут выровнены. Когда PDMS будет полностью выровнен, снимите напряжение, осторожно приподняв его с боков и углов. Затем выпекайте прибор в течение двух часов при температуре 80 градусов Цельсия после выпекания.

Разрежьте по периметру и отсоедините двухслойное устройство от отверстий для пробивки проточной формы, чтобы получить доступ к проточным каналам для создания конструкций ДНК для устройства. Проведите ПЦР для получения синтетических генов, состоящих из промотора Т-7, сайта связывания рибосом, открытой рамки считывания с различными эпитопными метками на обоих концах и терминатора Т-7. Чтобы подготовить синтетические гены к сборке, сделайте смесь полиэтиленгликоля и дигидрата триозы D. Диспенсируйте два микролитра на реакцию в лунки 384.

Колодец пластина. Добавьте синтетические гены в 384-луночный планшет. Затем добавьте дистиллированную воду до конечного объема 20 микролитров.

Затем, используя пятно микрочипа, ряд синтетических генов наносится на стеклянные подложки с эпоксидным покрытием. Под стереоскопом вручную выровняйте микрофлюидное устройство по массиву генов так, чтобы пятно ДНК располагалось в центре камер ДНК. Затем выровняйте остальные ряды.

В заключение мы проводим тонкую настройку всего устройства, чтобы снизить нагрузку на PDMS и обеспечить его хорошее сцепление с микрочипом. Поднимите его локально. Наконец, прикрепите устройство к предметному стеклу, инкубировав его в течение ночи на горячей плите при температуре 80 градусов Цельсия.

Пищевые красители используются в этом разделе для визуализации. Клапаны в управляющем слое приводятся в действие с компьютера с использованием лабораторного обзора. Сценарий лабораторного просмотра управляет серией электромагнитных микроклапанов через электронный блок управления.

Коллектор электромагнитного клапана подключен к сжатому воздуху, который регулирует расход воздуха и давление в регулирующие клапаны на устройстве. С помощью гибкой пластиковой трубки с внутренним диаметром 0,02 дюйма и штифта из нержавеющей стали подключите устройство к коллектору электромагнитных клапанов. Наполните трубки водой двойной дистилляции и вставьте штифт в отверстия для доступа контрольного слоя.

Убедитесь, что каждая трубка подключена к соответствующему каналу управления. Чтобы активировать каналы управления, запустите приложение lab view, установите давление воздуха на пять PS. Затем я подаю давление воздуха, активируя клапан из сценария лабораторного просмотра. Это будет проталкивать воду в каналы управления PDMS для выявления потенциальных перекрестных помех между каналами управления неисправных устройств.

Сначала заполните сэндвич и адресные клапаны. В конце концов, регулирующие каналы и клапаны заполнены водой, заправьте клапаны, чтобы перекрыть проточные каналы под ними. Сначала увеличив давление воздуха до 15 фунтов на квадратный дюйм, затем в программе лабораторного просмотра с помощью набора выключателей, подключенных к отдельным электромагнитным клапанам.

Активируйте все клапаны, включив все кнопки переключателя, чтобы убедиться, что все клапаны открыты. Подсоедините трубку к одному из входов потока, и при четырех-пяти фунтах на квадратный дюйм подайте воздух в устройство. Это освободит любые липкие клапаны от предметного стекла.

Теперь устройство подготовлено и готово к визуализации. Желтый пищевой краситель используется для визуализации реагентов в этом разделе, а бесцветный раствор представляет хиппи, чтобы облегчить самосборку белкового массива на поверхности и предотвратить неспецифическое поглощение внутри микрофлюидного устройства, химически модифицировать поверхность путем предварительного подключения новой трубки с требуемым раствором к одному из проточных каналов в устройстве. Затем подсоедините свободную сторону трубки к ручному коллектору и откройте поток воздуха.

Загрузите 40 микролитров биотина в новую пробирку и пропустите примерно половину его через устройство в течение 20 минут. Используйте 50 миллимолярных хиппи, чтобы смыть любой нереактивный субстрат между каждым из этапов. Далее влейте 25 микролитров стрептавидина в течение 20 минут.

Поверх биотина вымыть с помощью гена в течение пяти минут, чтобы съесть поверхность вокруг пуговицы, закрыть клапан кнопки и вылить оставшуюся часть биотинилированного БСА, а затем снова промыть с помощью гороха в течение пяти минут. Наконец, чтобы создать массив антишипящих меток под кнопкой, отпустите клапан кнопки и влейте 30 микролитров биотина Penta Hiss в течение 20 минут, чтобы создать массив белков на устройстве. Откройте горловину клапанов и налейте кроличий ретикулоцит.

Быстросопряженный раствор для транскрипции и трансляции реакции через устройство в камеру ДНК. Затем закройте сэндвич-клапаны, чтобы отделить каждый ген от окружающей среды, и инкубируйте устройство на горячей плите в течение 2,5 часов при температуре 30 градусов Цельсия. Затем пометьте конечный конец белков антителом C mix SI three.

Наконец, с помощью микрочипового сканера с лазером 532 нм и эмиссионным фильтром 575 нм. Определите уровень белка. На этом рисунке показаны различные уровни экспрессии белка в белковом массиве.

Обычно 20% библиотеки генов не экспрессируется до обнаруживаемых уровней. Фоновые уровни определяли с помощью камер, которые не были запятнаны ДНК. Таким образом, сигналы от соответствующих белковых камер обусловлены либо шумом, либо неспецифическим поглощением меченых антител.

Если она выполнена правильно, проверка устройства занимает четыре часа, а эксперимент с чипом — пять часов.