Сплит BioID — Протеомного анализа контекстно зависимых белковых комплексов в их родной среде сотовой

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы исследовать состав белковых комплексов, которые специфически собираются вокруг пары взаимодействующих белков, представляющих интерес, с помощью split-BioID, анализа комплементации белковых фрагментов, который индуцирует близко-зависимое биотинилирование белка в живых клетках. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы клеточной биологии, например, как белковые комплексы динамически ремоделируются, чтобы регулировать различные клеточные функции. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет легко идентифицировать контекстно-зависимые белковые комплексы в их родной клеточной среде и с очень высоким разрешением.

Для окончательного масс-спектрометрического анализа следующие этапы должны быть выполнены в условиях, свободных от кератина, и все материалы и реагенты должны быть как можно более свободными от кератина. После клонирования ORF двух представляющих интерес белков в расщепленную плазмиду BioID, проведения транзиторной трансфекции с последующим добавлением среды, дополненной биотином, в соответствии с текстовым протоколом, использовать PBS для двукратной промывки клеток. Добавьте 1,5 миллилитра PBS на каждую пластину и используйте скребок для сбора клеток, затем перенесите клетки для каждого состояния в отдельную 15-миллилитровую пробирку и вращайте трубки со скоростью, в 1,200 раза превышающей силу тяжести и четыре градуса Цельсия, в течение пяти минут.

Удалите надосадочную жидкость и заморозьте гранулы в жидком азоте. Затем храните пробирки при температуре минус 80 градусов Цельсия до дальнейшей обработки. Для приготовления клеточных лизатов используйте один миллилитр буфера для лизиса RT для ресуспендирования гранул.

Затем пропустите ячейки через иглу 25 калибра от 10 до 20 раз. Далее обработайте образцы ультразвуком. Затем добавьте 100 микролитров 20% Triton X-100 на 900 микролитров восстановленного лизата ультразвуком для конечной концентрации 2% Добавьте 2,3 миллилитра 50 миллимолярного Tris, pH 7,4, на миллилитр лизата, чтобы отрегулировать концентрацию NaCl до 150 миллимоляров для связывания с гранулами стрептавидина.

Затем распределите отрегулированные лизаты по пробиркам объемом 1,5 миллилитра и центрифугируйте их при 16 000-кратном течении силы тяжести и четырех градусах Цельсия в течение десяти минут. Перенесите надосадочную жидкость в пробирку объемом 15 миллилитров и оставьте от 50 до 100 микролитров в качестве исходного материала. Чтобы выполнить вытягивание стрептавидина, для каждого условия перенесите 200 микролитров магнитной суспензии стрептавидина в 1,5 миллилитровую трубку.

Поместите пробирки на магнитный штатив и подождите примерно одну минуту, прежде чем снять буфер для хранения. С одним миллилитром уравновешивающего буфера промойте шарики, аккуратно перемешивая. Затем равномерно разложите уравновешенные бусины в нужное количество пробирок и поместите их обратно на магнитный стеллаж.

После удаления уравновешивающего буфера повторно суспендируйте каждый набор шариков с равным количеством соответствующих клеточных лизатов. Затем инкубируйте образцы при температуре четыре градуса Цельсия на вращающемся колесе в течение ночи. На следующий день поместите пробирки на магнитную решетку.

Подождите, пока шарики прилипнут к боковым стенкам пробирок, и перенесите надосадочную жидкость в 15-миллилитровую трубку с маркировкой как протока. С помощью 200 микролитров промывочного буфера повторно суспендируйте шарики в каждой трубке и соедините каждый набор ресуспендированных бусин, соответствующих одному условию, в 1,5 миллилитровых тубах. Используйте один миллилитр буфера для стирки, чтобы дважды промыть бусины на вращающемся колесе в течение восьми минут.

Затем выполните по две промывки для буферов второй, третьей и четвертой. Чтобы убедиться в том, что буфер промывки полностью удален после последнего этапа промывки, после удаления большей части надосадочной жидкости отжимайте образцы вниз. Затем положите их обратно на магнитную стойку и снимите оставшийся буфер.

Добавьте в шарики 30 микролитров элюирующего буфера, затем инкубируйте образцы при температуре 98 градусов Цельсия в течение пятнадцати минут и сразу же переместите пробирки на магнитную стойку. Переложите элюированный образец в свежую пробирку и храните пробирки при температуре минус 20 градусов Цельсия до дальнейшей обработки. Для каждого входного образца готовят образец PAGE, смешивая равные количества белка с соответствующим объемом 3X SDS загрузочного буфера в общем объеме 28 мкл.

Затем приготовьте образцы PAGE, смешав пять микролитров каждого образца элюирования с 2,5 микролитрами загрузочного буфера 3X SDS. Загрузите образцы в полиакриламидный гель SDS. Затем приступают к электрофорезу и вестерн-блоттингу согласно текстовому протоколу.

Чтобы провести анализ SDS-PAGE для МС, добавьте 6,25 микролитров буфера для образцов 4X к 18,75 микролитрам каждого образца элюирования и запустите образцы на 4-20% предварительно литого геля SDS до тех пор, пока они не мигрируют на два-три сантиметра внутрь геля. В 15-сантиметровой чашке Петри нанесите гель коллоидным красителем Coomassie Brilliant Blue G250. Чистым скальпелем исчерпайте целые полосы для каждого образца, исключая полосу стрептавидина, и перенесите вырезанные полосы в пробирки объемом 1,5 миллилитра для анализа РС.

В дополнение к эндогенным биотинилированным белкам, идентифицированным в эксперименте BioID (расщепленный BioID), дополнительными основными полосами, наблюдаемыми с помощью вестерн-блоттинга, являются гибридные белки, которые самобиотинилировались, что указывает на то, что два тестируемых белка, в данном примере Ago2 и TNRC6C или Ago2 и Dicer, взаимодействовали в клетках. Кроме того, результаты вестерн-блоттинга указывают на то, что слияние белка NBirA*Ago2 в паре со слиянием CBirA* с TNRC6C или Dicer является более эффективным, чем противоположные комбинации, в которых CBirA*Ago2 сочетается со слиянием NBirA* двух других белков. Более того, активация была специфичной, так как ни один из слияний CBirA*GFP не мог активировать контрольный гибридный белок NBirA*GFP до заметных уровней.

При проведении изоляции в первый раз все этапы очистки должны быть проанализированы с помощью вестерн-блоттинга. Как показано здесь, привязка к бусинам должна быть почти количественной и практически не должно наблюдаться протекания в стирках. Когда элюированный материал наносят на окрашенный гель Кумасси после экспрессии белка и индуцированного биотинилирования, самая сильная наблюдаемая полоса имеет концентрацию около 17 килодальтон и соответствует мономерному стрептавидину.

Площадь полосы отбора проб над полосой стрептавидина вверх по загрузочной скважине обычно иссекается для анализа МС. При применении этой процедуры к двум данным белкам важно протестировать различные комбинации гибридных белков. Действительно, мы часто наблюдаем, что общая эффективность биотинилирования может тесно зависеть от того, какой белок присоединяется к N- или C-концевым фрагментам BirA.

Не менее важно добавить хотя бы один эксперимент с расщепленным биоID с отрицательным контролем. Например, на паре взаимодействующих белков, которые не связаны с интересующей парой белков. После этой процедуры и масс-спектрометрии следует применить вычислительный анализ для оценки идентифицированных пептидов по сравнению с экспериментами с отрицательным контролем.

Мы используем, например, программное обеспечение MaxQuant и Perseus, разработанное лабораториями Кокса и Манна в Мюнхене, Германия.