Создание, тестирование и использование селективного микроэлектродов ионов калия в срезах тканей взрослого мозга

Общая цель этого метода заключается в изготовлении, калибровке и использовании монополярных ионоселективных микроэлектродов на основе калия. Использование таких электродов позволяет количественно оценить динамику концентрации вызванных ионов калия в срезах мозга взрослого человека. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы физиологии, такие как выявление клеточных и молекулярных механизмов гомеостаза ионов калия в центральной нервной системе.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что, помимо того, что микроэлектродные датчики являются простым и понятным методом изготовления, они представляют собой золотой стандарт для измерения концентрации ионов калия. Чтобы подготовить капилляры из боросиликатного стекла к силанизации, поместите их в 50-миллилитровую коническую трубку. Заполните коническую трубку одномолярной соляной кислотой и инкубируйте стеклянные капилляры в соляной кислоте с легким перемешиванием в течение ночи в течение минимум шести часов.

После этого кратко промойте капилляры 70% этанолом, а затем полностью высушите их при температуре от 100 до 120 градусов Цельсия в течение шести-восьми часов. Промытые капилляры хранят в емкостях с безводным влагопоглотителем сульфата кальция до четырех недель перед дальнейшим использованием. Перед силанизацией оттяните капилляры до тонкого кончика с помощью съемника микроэлектродов.

Затем поместите микроэлектроды в стеклянную емкость с помощью автоклавируемой ленты так, чтобы электроды были приподняты снизу, чтобы предотвратить поломку кончика. Затем удалите примерно 0,5 миллилитра 5% раствора силанизации DDS из емкости с помощью азотозаместительного метода. Наполните баллон газообразным азотом и прикрепите к нему шприц или трубку и иглу.

Затем вставьте иглу в контейнер DDS, одновременно набирая DDS в отдельный шприц с помощью более длинной иглы. Впоследствии нанесите раствор силанизации по каплям на кончики пипеток и сразу же накройте емкость. Поместите контейнер с микроэлектродами с раствором силанизации в предварительно разогретую лабораторную печь при температуре от 170 до 180 градусов Цельсия на 10-12 часов или при температуре от 200 до 220 градусов Цельсия на 30 минут.

После инкубации достаньте тарелку из духовки. Поставьте тарелку на скамейку при комнатной температуре на 10-15 минут, чтобы стеклянная посуда остыла. Извлеките микроэлектроды из пластины и поместите их в герметичный контейнер, заполненный влагопоглотителем.

Силанизированные микроэлектроды, защищенные от влаги, можно использовать в течение одной недели после силанизации. Чтобы загрунтовать электроды, приготовьте исходный раствор коктейля из ионофора калия и держите его в герметичной непрозрачной емкости при комнатной температуре. Далее приготовьте стоковый раствор 10-миллимолярного HEPES-буферизованного 300-миллимолярного хлорида натрия при pH 7,4.

Закрепите электрод в зажиме. Затем, используя тупой инструмент, загребите кончик электрода примерно до 10-20 микрометров в ширину, затем заполните электрод буферизованным хлоридом натрия HEPES, используя наконечник MicroFil 28 калибра, соединенный со шприцем. Следите за тем, чтобы солевой раствор достиг конца наконечника микроэлектрода, и убедитесь, что на микроэлектроде нет крупных пузырьков, которые могут мешать протеканию тока.

С помощью микропипетки нанесите небольшую каплю ионофора калия возле кончика микроэлектрода. Если электрод был правильно силанирован, капля впитается в сломанный наконечник. Заполните электрод примерно на 1 миллиметр ионофором калия и удалите излишки с помощью папиросной бумаги.

Чтобы откалибровать микроэлектроды, проведите пузырьки на всех калибровочных и срежьте буферные растворы с 95% кислорода/5% углекислого газа не менее чем за 20 минут до начала эксперимента. Начинают перфузию ванны с 4,5-миллимолярного ионосодержащего калия АКСФ со скоростью три миллилитра в минуту. Поместите ионоселективный электрод калия в держатель электрода, прикрепленный к электродному столику на манипуляторе.

Затем вставьте наконечник электрода в ванну с перфузатом. Убедитесь, что заземляющий электрод из серебра/хлорида серебра погружен в один и тот же раствор и поток является постоянным. Применяйте калибровочные растворы поэтапно и записывайте потенциальные изменения в милливольтах на наконечнике электрода.

Подождите, пока потенциал на кончике электрода достигнет стабильного значения, прежде чем переходить к следующему раствору. Затем измерьте равноценное изменение напряжения в ответ на нанесение калибровочных растворов на наконечник электрода. Убедитесь, что наклон отклика электродного напряжения составляет не менее 52 и не более 59 милливольт на десятикратное изменение концентрации калия.

Чтобы приготовить срезы гиппокампа, сделайте двух-трехсантиметровый надрез от каудальной части черепа, чтобы разрезать кожу головы по средней линии. Во время ручного втягивания волосистой части головы сделайте два горизонтальных разреза по одному сантиметру от большого затылочного отверстия по бокам черепа. Затем с помощью тонких секаторов сделайте разрез по средней линии от задней части черепа к носу.

Далее введите тонкие щипцы возле средней линии и втяните надрезанный череп двумя частями. Извлеките мозг мыши из черепа и с помощью лезвия удалите мозжечок, префронтальную кору и обонятельные луковицы, которые расположены соответственно в каудальной и ростральной частях мозга. Затем установите мозговой блок на вибратомный лоток с помощью суперклея.

Наполните вибратомный поддон раствором для холодной резки. После этого разрежьте срезы тканей на корональной равнине толщиной 300 микрометров. Обычно можно собрать от четырех до шести корональных срезов гиппокампа.

После того, как каждый срез будет разрезан, сразу же переложите ломтик в стакан для срезов, нагретый до 32-34 градусов Цельсия. Держите секции при этой температуре в течение 20 минут, прежде чем перенести стакан с секциями в комнатную температуру не менее чем за 20-30 минут до записи. Чтобы измерить динамику ионов калия, аккуратно поместите срез мозга в ванну с помощью пастеровской пипетки и аккуратно удерживайте его на месте платиновой арфой с нейлоновыми струнами.

Убедитесь, что кончики биполярного стимулирующего электрода расположены примерно параллельно друг другу и находятся на уровне плоскости среза. В течение пяти-семи секунд медленно вводите электроды в лучистый слой CA3 на глубину примерно от 40 до 50 микрометров, чтобы стимулировать коллатерали Шаффера. Затем осторожно введите ионоселективный электрод калия в лучистый слой CA1 на глубину примерно 50 микрометров, медленно опуская электрод в течение примерно трех-четырех секунд.

Дайте потенциалу стабилизироваться на электроде, прежде чем применять стимуляцию к срезу, что обычно занимает от пяти до 10 минут. Если срез демонстрирует чрезмерные спонтанные изменения концентрации внеклеточных ионов калия, откажитесь и повторите процесс с новым срезом. Чтобы измерить вызванное высвобождение ионов калия, применяйте последовательности электрических стимуляций через изолятор стимулов во время цифровой записи ответов.

Применяйте стимуляцию с частотой 10 Гц и одной миллисекундой на импульс, начиная с амплитуды стимула 10 микроампер. Применяйте увеличивающие амплитуды стимуляции в два раза до тех пор, пока не будет обнаружена максимальная амплитуда реакции калия. Если реакции не наблюдается, переместите положение ионселективного электрода калия ближе к месту стимуляции с шагом 100 микрометров.

Чтобы подтвердить, что изменения концентрации ионов калия опосредованы возбуждением потенциала действия электрически активированных коллатералей Шаффера, ванну наносят 0,5 микромолярного TTX в ACSF в течение 10 минут и повторяют протокол стимуляции. Не следует наблюдать никаких вызванных реакций. После загрунтовки электродов залитым солевым раствором HEPES и ионофором калия электроды могут быть проверены на их быструю реакцию на ступенчатые изменения концентраций ионов калия в ванне и на линейную реакцию на изменения ионов калия в ванне в диапазоне калибровки от 0,1 до 100 миллимоляров способом, предсказанным уравнением Нернста.

Установившийся потенциал может быть построен в зависимости от концентрации ионов калия в ванне, чтобы определить наклон линии, который должен составлять приблизительно V 58,2 милливольт и не менее 52 милливольт на десятикратное изменение концентрации ионов калия. В дальнейшем была проверена реакция калий-селективных электродов, и наблюдалась реакция на 5,5 миллимолярного увеличения калия с константами времени нарастания и затухания примерно 85 миллисекунд. После того, как стимулирующие и калий-ионоселективные электроды введены в ткань и запись достигла стабильного исходного уровня, можно применять импульсы с возрастающей амплитудой тока.

Форма волны этой активности проявляется в виде быстрого увеличения калия с экспоненциальной скоростью распада, которая устраняется при применении ТТХ. После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за три-четыре часа, если она выполняется аккуратно и аккуратно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что наконечник электрода должен быть как можно меньше, чтобы обеспечить точную запись, но достаточно большим, чтобы обеспечить низкий уровень шума.