Характеристика белков по размеру-исключение хроматографии в сочетании с многоугловой рассеяния света (SEC-MALS)
June 20th, 2019
Этот протокол описывает сочетание хроматографии исключения размера с многоугольным рассеянием света (SEC-MALS) для абсолютной характеристики белков и комплексов в растворе. SEC-MALS определяет молекулярный вес и размер чистых белков, местных олигомеров, гетерокомплексов и модифицированных белков, таких как гликопротеины.
SEC-MALS является количественным методом для определения молекулярного веса, размера и конформации макромолекул в растворе. Он может идентифицировать олигомеры и комплексы, а также характеризовать сложные образцы, такие как гликопротеины и мембранные белки. SEC-MALS является абсолютным методом.
Она опирается на фундаментальную физику и не зависит от сотрудничества с молекулярными стандартами, конформацией молекулы или тем, как мы взаимодействуем со средой разделения. SEC-MALS может быть применен ко многим системам, которые разделены sec. От пептидов и мелких полимеров до белков, нуклеокапсидов, полисахаридов, синтетических полимеров, вирусопоялных частиц и мелких вирусов.
Важно убедиться, что ваша система и буферы не содержат рекомендаций поставщика относительно низкого содержания твердых частиц. Проконсультируйтесь с представителем технической поддержки поставщика, чтобы быть уверенным. Начните эту процедуру с подготовки системы SEC-MALS, как описано в текстовом протоколе.
Используя каждый реагенты plc-класса, подготовьте один литр фосфатно-буферного солевого раствора с хлоридом натрия от 50 до 100 миллимолярдов. Фильтр буфера до 0,1 микрона с помощью разлитого в бутылку фильтра пены полиэтер клеток, или аналогичный. Фильтр первых 50 до 100 миллилитров буфера в бутылку отходов, с тем чтобы устранить частицы из сухих фильтров.
Затем отфильтруй остаток в чистую стерильную бутылку, которая ранее промылась фильтрованной, деионизированной водой и хранилась для предотвращения поступления пыли. Промыть столбец на ночь со скоростью потока 0,5 миллилитров в минуту, чтобы уравночные колонны в буфере и удалить частицы. Используйте режим непрерывного потока FPLC и убедитесь, что поток не остановится до тех пор, пока не будут завершены все запуски SEC-MALS.
Поместите ячейку потока DRI в режим чистки во время ночного флеша. При начале флеша постепенно увеличивайте скорость потока, чтобы предотвратить эффект пролития столбца, вызванный внезапной сменой давления в столбце. Выключите очистку перед началом пробных запусков.
Проверьте чистоту системы, слегка нажав трубки вниз по течению от столбца, чтобы освободить накопленные частицы. Наблюдайте за сигналом в детекторе 90 градусов на дисплее передней панели прибора MALS. Убедитесь, что пик-пик шума не более 50-100 микровольт.
Также убедитесь, что рефракционный индекс, или RI-сигнал, стабилен менее чем в 1 раз в десять до минус семи рефракционных единиц индекса. Выполните пустую инъекцию, чтобы убедиться, что инжектор чист от частиц. Пустой - это просто бегущий буфер, приготовленный в свежем стерильном флаконе.
Если пик частиц не превышает одного миллилитра в объеме и не более пяти милливольт выше базового уровня, то система готова к образцам. В противном случае, выполнять дополнительные пустые инъекции до чистой, или выполнять техническое обслуживание для очистки инжектора. Теперь подготовь по крайней мере 200 микролитров BSA по одному-двум миллиграммам на миллилитр в буфере SCC.
Фильтр белка до 02 микрон, используя фильтр кончика шприца. Отбросьте первые несколько капель фильтрата, чтобы исключить частицы из сухих фильтров. Кроме того, центрифуга образца в 10 000 раз G в течение пятнадцати минут, чтобы обеспечить осадки нерастворимых агрегатов и других крупных частиц.
Затем ввеми 100 микролитров раствора BSA в петлю. Откройте новый эксперимент с методом в программном меню MALS. Затем выберите онлайн-метод из папки методов рассеяния света.
Если детектор DLS присутствует, выберите онлайн-метод из рассеяния света с папкой «ЗЕЛС». Установите параметры образца и мобильной фазы в разделе конфигурации. В общем представлении насоса установите скорость потока на скорость, используемую в FPLC.
Затем перейдите на общий вид насоса, ветвь растворителя, поле имен и выберите PBS. В представлении инжектора, ветке образца, введите имя как BSA. Установите dn/dc до 0.185, установите A2 к 0 и установите коэффициент УФ-вымирания до 0,667 миллилитров на миллиграмм сантиметра.
В разделе процедур базовое представление коллекции выберите триггер checkbox на автоматическом впрыске. Установите продолжительность пробега до 70 минут, чтобы данные собирались для всего аллюзии, пока не будет достигнут общий объем пронизывания столбца SEC. Начните эксперимент в программном обеспечении MALS, нажав кнопку запуска.
Он начнет считыв данные после получения импульсного сигнала от прибора FPLC через детектор MALS. Нулевой сигнал DRI, нажав кнопку автоматического нуля на передней панели инструмента. Работая в программном обеспечении FPLC, перейдите на руководство, выполняйте инструкции, установите отметку и вставьте название белка и пробег.
Переключите клапан впрыска с ручной нагрузки на впрыск, под траекторию потока, инъекционный клапан. Включите импульсный сигнал, вставив 0,5-секундный импульс под io-бокс импульс цифровой из. Это вызовет сбор данных в программном обеспечении MALS.
Теперь ввими образец в петлю. Нажмите выполнить в программном обеспечении FPLC, чтобы начать эксперимент запуска. Выполняем анализ шаг за шагом, в разделе процедур в программном обеспечении MALS.
Убедитесь, что пики отображаются примерно на томе аллюзии в UV, MALS и RI, проверив базовое представление коллекции. В базовом представлении определите базовый уровень для всех сигналов. В представлении пиков определите пики, которые необходимо проанализировать, нажав и перетащив мышь.
Выберите центральные 50% каждого пика. Сначала выберите мономерный пик, а затем пик димера. Под каждым пиком проверяйте правильные значения dn/dc и коэффициент вымирания на уровне 280 нанометров для BSA.
В процедурах, выравнивание зрения, выберите центральную область пиков, нажав и перетащить мышь. Нажмите выровнять сигналы, а затем хорошо. В процедурах, диапазон расширения зрения, выбрать центральный 50% мономерный пик.
Убедитесь, что детектор рефракционного индекса указан в качестве эталонного инструмента. Затем нажмите выполнить нужным, и применить в матче УФ и свет рассеяния сигналов к рефракционного сигнала индекса. Увеличьте пики, чтобы убедиться, что они очень тесно перекрываются в пределах центральных 50 до 70%, а затем нажмите хорошо.
В процедурах, нормализации зрения, выберите пик один. Введите 3,0 нанометров, как значение RG, нажмите нормализовать, а затем нажмите хорошо. Просмотр графика результатов в представлении графика EASI.
Выберите молярную массу с дисплея, опустите ее в верхней части окна. Используйте элемент управления, нажмите кнопку и перетащите, чтобы увеличить область пика. Чтобы просмотреть окончательные результаты средней молярной массы в таблице для мономерных и затемненных пиков, перейдите к пиковым результатам, молярным массовым моментам, МВт и выберите результаты, сообщите резюме.
Чистота сообщается при пиковых результатах, массовая фракция. Из меню файлов выберите сохранить в качестве метода, и сохранить проанализированные данные BSA в качестве стандартного метода для будущих измерений всех типов белков. Нормализация и расширение полосы параметров, определенных для BSA, будут перенесены в анализе.
Здесь показаны анализы BSA SEC-MALS с использованием столбца исключения размера поры 200 Angstrom. Следы хроматограммы нормализуются до пика мономера и компенсируются для ясности. Общие артефакты, которые могут быть проигнорированы, указываются, в том числе пик частиц в начале сигнала рассеяния света, а также соли и растворенных пиков воздуха вблизи общего объема пронизывания в сигнале рефракционного индекса.
Хроматограмма демонстрирует отличное разделение мономера-димера-тримера, а светоразбрасывной сигнал демонстрирует высокий сигнал к шуму. Мономерные и более тусклые средние значения молярной массы демонстрируют высокую однородность. Вот примеры низкого качества анализа SEC-MALS.
В этом примере неадекватное разделение на столбце исключения размера поры 75 Ангстрем приводит к пику частиц от восьми до девяти минут, что не очень хорошо отделено от белков. Здесь существует неадекватное отношение сигнала к шуму, и обширные частицы, прилегающие к белкам, очевидны в сигнале рассеяния света. Ключами к хорошим результатам SEC-MALS являются выбор соответствующей колонки, обеспечение калибровки системы с низким уровнем освещенности, а также предварительная фильтрация или центрифугирование образцов для удаления частиц.
После SEC-MALS, образцы протеина можно более далее проанализировать для связывая сродства, bioliza, резонанса плазмона поверхности, isothermal кальциметрии titration, биолеридной phorometry, микромасштабного термофореза, или градиента состава, multi-angle рассеяния света. Структура белка может быть определена с помощью рентгеновской кристаллографии, криоэлектронной микроскопии или ЯМР.
Обзор
Этот протокол описывает сочетание хроматографии с исключением размеров с многоугольным анализом светорассеивания (SEC-MALS) для абсолютной характеристики белков и комплексов в растворе. SEC-MALS определяет молекулярный вес и размер чистых белков, нативных олигомера, гетерокомплексов и модифицированных белков, таких как гликопротеины.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Биохимия
- Характеристика белков
- Аналитическая химия
Предыстория
- SEC-MALS является количественным методом для определения молекулярного веса и размера.
- Он может идентифицировать олигомеры и комплексы, включая гликопротеины.
- Этот метод не зависит от молекулярных стандартов.
- Применим к широкому спектру макромолекул.
Цель исследования
- Обеспечить надежный метод для характеристики белков в растворе.
- Облегчить анализ сложных биологических образцов.
- Улучшить понимание взаимодействий и структур белков.
Используемые методы
- Подготовка системы SEC-MALS и буферов.
- Фильтрация и промывка системы для обеспечения чистоты.
- Подготовка образцов и их введение в систему SEC-MALS.
- Сбор и анализ данных с использованием ПО MALS.
Основные результаты
- Успешная характеристика белков и комплексов.
- Проверка чистоты системы и целостности образцов.
- Точное определение молекулярных весов и размеров.
- Идентификация олигомера и комплексов в образцах.
Выводы
- SEC-MALS является эффективным методом для характеристики белков.
- Он предоставляет абсолютные измерения без зависимости от стандартов.
- Эта техника может применяться к различным биологическим макромолекулам.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
SEC-MALS provides absolute molecular weight and size characterization of proteins and complexes in solution, eliminating reliance on molecular standards and reducing analytical uncertainty in early discovery. This capability supports target validation by confirming the biophysical state of therapeutic candidates, including oligomers, aggregates, and modified species such as glycoproteins. By delivering quantitative, conformation-independent data, SEC-MALS enhances predictive confidence in protein behavior, informing go/no-go decisions and reducing late-stage biological risk in biopharma R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Confirms homogeneity and molecular weight of protein monomers, oligomers, and complexes, enabling accurate assessment of therapeutic target integrity.
- Operational Value: Distinguishes between static and dynamic protein equilibria, clarifying whether observed species represent stable assemblies or transient interactions.
- Predictive Value: Detects aggregates and heterogeneous populations early, supporting risk-adjusted prioritization of candidates before downstream investment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Enables analysis of modified proteins such as glycoproteins and detergent-solubilized membrane proteins, expanding the range of tractable targets for screening campaigns.
- Operational Value: Provides quantitative, absolute molecular weight measurements at each elution volume, facilitating assay standardization and reproducibility across laboratories.
- Platform Utility: Generates reference data for BSA and other standards that can be saved as methods for future SEC-MALS runs, promoting enterprise-wide reuse and consistency.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports characterization of protein complexes and modified forms relevant to disease mechanisms, bridging discovery and preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Determines whether observed species arise from covalent modification, non-specific aggregation, or specific oligomerization, clarifying mechanism of action and formulation risks.
- Preclinical Alignment: Delivers solution-based size and conformation data that complement structural techniques like cryo-EM or NMR, enabling integrated target profiling.
Pipeline & Workflow Integration
SEC-MALS functions as a foundational analytical step in the discovery continuum, positioned after protein expression and purification but before functional assays or structural determination, ensuring that only properly characterized molecules advance in the pipeline.
- Discovery Biology: Validates the oligomeric state and monodispersity of purified proteins, reducing false positives in target engagement and signaling assays.
- Screening: Ensures that protein ligands or analytes used in screening assays are well-defined and homogeneous, improving data quality and hit confirmation rates.
- Analytics: Delivers weight-average molar mass, size, and mass fraction outputs that enable direct comparison of protein variants, mutants, or formulation conditions.
- Translational Research: Characterizes glycoproteins and membrane protein complexes in near-native conditions, supporting biomarker relevance and mechanism-of-action studies.
- Enterprise Reuse: Allows laboratories to save validated methods (e.g., BSA-based) for broad application across projects, reducing method development time and increasing analytical throughput.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides absolute, conformation-independent molecular weight determination, increasing confidence in target identity and reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Enables system suitability checks via blank injections and particle monitoring, ensuring reproducible runs and minimizing failed experiments due to contamination.
- Strategic Value: Supports early detection of aggregation and heterogeneity, informing formulation development and reducing risk of late-stage failure due to instability.
- Portfolio Impact: Enables data-driven go/no-go decisions based on biophysical quality, improving capital efficiency and advancing only well-characterized candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, buffer preparation, and SEC-MALS system operation, including MALS detector alignment and normalization procedures.
- Dependent on access to a calibrated SEC-MALS system with low-noise light scattering and refractive index detectors, and appropriate columns (e.g., 200 Å pore size for BSA).
- Necessitates rigorous sample and buffer filtration (0.1–0.2 μm) and system flushing to eliminate particulates that can scatter light and compromise data quality.
- Requires accurate input of protein-specific parameters such as dn/dc and UV extinction coefficient in the MALS software for valid molecular weight calculations.
- Limited by the need for monodisperse, soluble samples; precipitates or large aggregates must be removed via centrifugation or filtration prior to injection to avoid column clogging and signal artifacts.
