Характеристика белков по размеру-исключение хроматографии в сочетании с многоугловой рассеяния света (SEC-MALS)
20 июня 2019 г.
Этот протокол описывает сочетание хроматографии исключения размера с многоугольным рассеянием света (SEC-MALS) для абсолютной характеристики белков и комплексов в растворе. SEC-MALS определяет молекулярный вес и размер чистых белков, местных олигомеров, гетерокомплексов и модифицированных белков, таких как гликопротеины.
SEC-MALS является количественным методом для определения молекулярного веса, размера и конформации макромолекул в растворе. Он может идентифицировать олигомеры и комплексы, а также характеризовать сложные образцы, такие как гликопротеины и мембранные белки. SEC-MALS является абсолютным методом.
Она опирается на фундаментальную физику и не зависит от сотрудничества с молекулярными стандартами, конформацией молекулы или тем, как мы взаимодействуем со средой разделения. SEC-MALS может быть применен ко многим системам, которые разделены sec. От пептидов и мелких полимеров до белков, нуклеокапсидов, полисахаридов, синтетических полимеров, вирусопоялных частиц и мелких вирусов.
Важно убедиться, что ваша система и буферы не содержат рекомендаций поставщика относительно низкого содержания твердых частиц. Проконсультируйтесь с представителем технической поддержки поставщика, чтобы быть уверенным. Начните эту процедуру с подготовки системы SEC-MALS, как описано в текстовом протоколе.
Используя каждый реагенты plc-класса, подготовьте один литр фосфатно-буферного солевого раствора с хлоридом натрия от 50 до 100 миллимолярдов. Фильтр буфера до 0,1 микрона с помощью разлитого в бутылку фильтра пены полиэтер клеток, или аналогичный. Фильтр первых 50 до 100 миллилитров буфера в бутылку отходов, с тем чтобы устранить частицы из сухих фильтров.
Затем отфильтруй остаток в чистую стерильную бутылку, которая ранее промылась фильтрованной, деионизированной водой и хранилась для предотвращения поступления пыли. Промыть столбец на ночь со скоростью потока 0,5 миллилитров в минуту, чтобы уравночные колонны в буфере и удалить частицы. Используйте режим непрерывного потока FPLC и убедитесь, что поток не остановится до тех пор, пока не будут завершены все запуски SEC-MALS.
Поместите ячейку потока DRI в режим чистки во время ночного флеша. При начале флеша постепенно увеличивайте скорость потока, чтобы предотвратить эффект пролития столбца, вызванный внезапной сменой давления в столбце. Выключите очистку перед началом пробных запусков.
Проверьте чистоту системы, слегка нажав трубки вниз по течению от столбца, чтобы освободить накопленные частицы. Наблюдайте за сигналом в детекторе 90 градусов на дисплее передней панели прибора MALS. Убедитесь, что пик-пик шума не более 50-100 микровольт.
Также убедитесь, что рефракционный индекс, или RI-сигнал, стабилен менее чем в 1 раз в десять до минус семи рефракционных единиц индекса. Выполните пустую инъекцию, чтобы убедиться, что инжектор чист от частиц. Пустой - это просто бегущий буфер, приготовленный в свежем стерильном флаконе.
Если пик частиц не превышает одного миллилитра в объеме и не более пяти милливольт выше базового уровня, то система готова к образцам. В противном случае, выполнять дополнительные пустые инъекции до чистой, или выполнять техническое обслуживание для очистки инжектора. Теперь подготовь по крайней мере 200 микролитров BSA по одному-двум миллиграммам на миллилитр в буфере SCC.
Фильтр белка до 02 микрон, используя фильтр кончика шприца. Отбросьте первые несколько капель фильтрата, чтобы исключить частицы из сухих фильтров. Кроме того, центрифуга образца в 10 000 раз G в течение пятнадцати минут, чтобы обеспечить осадки нерастворимых агрегатов и других крупных частиц.
Затем ввеми 100 микролитров раствора BSA в петлю. Откройте новый эксперимент с методом в программном меню MALS. Затем выберите онлайн-метод из папки методов рассеяния света.
Если детектор DLS присутствует, выберите онлайн-метод из рассеяния света с папкой «ЗЕЛС». Установите параметры образца и мобильной фазы в разделе конфигурации. В общем представлении насоса установите скорость потока на скорость, используемую в FPLC.
Затем перейдите на общий вид насоса, ветвь растворителя, поле имен и выберите PBS. В представлении инжектора, ветке образца, введите имя как BSA. Установите dn/dc до 0.185, установите A2 к 0 и установите коэффициент УФ-вымирания до 0,667 миллилитров на миллиграмм сантиметра.
В разделе процедур базовое представление коллекции выберите триггер checkbox на автоматическом впрыске. Установите продолжительность пробега до 70 минут, чтобы данные собирались для всего аллюзии, пока не будет достигнут общий объем пронизывания столбца SEC. Начните эксперимент в программном обеспечении MALS, нажав кнопку запуска.
Он начнет считыв данные после получения импульсного сигнала от прибора FPLC через детектор MALS. Нулевой сигнал DRI, нажав кнопку автоматического нуля на передней панели инструмента. Работая в программном обеспечении FPLC, перейдите на руководство, выполняйте инструкции, установите отметку и вставьте название белка и пробег.
Переключите клапан впрыска с ручной нагрузки на впрыск, под траекторию потока, инъекционный клапан. Включите импульсный сигнал, вставив 0,5-секундный импульс под io-бокс импульс цифровой из. Это вызовет сбор данных в программном обеспечении MALS.
Теперь ввими образец в петлю. Нажмите выполнить в программном обеспечении FPLC, чтобы начать эксперимент запуска. Выполняем анализ шаг за шагом, в разделе процедур в программном обеспечении MALS.
Убедитесь, что пики отображаются примерно на томе аллюзии в UV, MALS и RI, проверив базовое представление коллекции. В базовом представлении определите базовый уровень для всех сигналов. В представлении пиков определите пики, которые необходимо проанализировать, нажав и перетащив мышь.
Выберите центральные 50% каждого пика. Сначала выберите мономерный пик, а затем пик димера. Под каждым пиком проверяйте правильные значения dn/dc и коэффициент вымирания на уровне 280 нанометров для BSA.
В процедурах, выравнивание зрения, выберите центральную область пиков, нажав и перетащить мышь. Нажмите выровнять сигналы, а затем хорошо. В процедурах, диапазон расширения зрения, выбрать центральный 50% мономерный пик.
Убедитесь, что детектор рефракционного индекса указан в качестве эталонного инструмента. Затем нажмите выполнить нужным, и применить в матче УФ и свет рассеяния сигналов к рефракционного сигнала индекса. Увеличьте пики, чтобы убедиться, что они очень тесно перекрываются в пределах центральных 50 до 70%, а затем нажмите хорошо.
В процедурах, нормализации зрения, выберите пик один. Введите 3,0 нанометров, как значение RG, нажмите нормализовать, а затем нажмите хорошо. Просмотр графика результатов в представлении графика EASI.
Выберите молярную массу с дисплея, опустите ее в верхней части окна. Используйте элемент управления, нажмите кнопку и перетащите, чтобы увеличить область пика. Чтобы просмотреть окончательные результаты средней молярной массы в таблице для мономерных и затемненных пиков, перейдите к пиковым результатам, молярным массовым моментам, МВт и выберите результаты, сообщите резюме.
Чистота сообщается при пиковых результатах, массовая фракция. Из меню файлов выберите сохранить в качестве метода, и сохранить проанализированные данные BSA в качестве стандартного метода для будущих измерений всех типов белков. Нормализация и расширение полосы параметров, определенных для BSA, будут перенесены в анализе.
Здесь показаны анализы BSA SEC-MALS с использованием столбца исключения размера поры 200 Angstrom. Следы хроматограммы нормализуются до пика мономера и компенсируются для ясности. Общие артефакты, которые могут быть проигнорированы, указываются, в том числе пик частиц в начале сигнала рассеяния света, а также соли и растворенных пиков воздуха вблизи общего объема пронизывания в сигнале рефракционного индекса.
Хроматограмма демонстрирует отличное разделение мономера-димера-тримера, а светоразбрасывной сигнал демонстрирует высокий сигнал к шуму. Мономерные и более тусклые средние значения молярной массы демонстрируют высокую однородность. Вот примеры низкого качества анализа SEC-MALS.
В этом примере неадекватное разделение на столбце исключения размера поры 75 Ангстрем приводит к пику частиц от восьми до девяти минут, что не очень хорошо отделено от белков. Здесь существует неадекватное отношение сигнала к шуму, и обширные частицы, прилегающие к белкам, очевидны в сигнале рассеяния света. Ключами к хорошим результатам SEC-MALS являются выбор соответствующей колонки, обеспечение калибровки системы с низким уровнем освещенности, а также предварительная фильтрация или центрифугирование образцов для удаления частиц.
После SEC-MALS, образцы протеина можно более далее проанализировать для связывая сродства, bioliza, резонанса плазмона поверхности, isothermal кальциметрии titration, биолеридной phorometry, микромасштабного термофореза, или градиента состава, multi-angle рассеяния света. Структура белка может быть определена с помощью рентгеновской кристаллографии, криоэлектронной микроскопии или ЯМР.
Обзор
В данном протоколе описывается сочетание эксклюзионной хроматографии с многоугловым светорассеянием (SEC-MALS) для абсолютной характеристики белков и комплексов в растворе. Метод SEC-MALS позволяет определять молекулярную массу и размер чистых белков, нативных олигомеров, гетерокомплексов и модифицированных белков, таких как гликопротеины.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биохимия
- Характеристика белков
- Аналитическая химия
Теоретические основы
- SEC-MALS — это количественный метод определения молекулярной массы и размера.
- Он позволяет идентифицировать олигомеры и комплексы, включая гликопротеины.
- Данный метод не зависит от молекулярных стандартов.
- Применим к широкому спектру макромолекул.
Цель исследования
- Предоставить надежный метод характеризации белков в растворе.
- Облегчить анализ сложных биологических образцов.
- Углубить понимание структур и взаимодействий белков.
Используемые методы
- Подготовка системы SEC-MALS и буферов.
- Фильтрация и промывка системы для обеспечения чистоты.
- Подготовка образца и его ввод в систему SEC-MALS.
- Сбор и анализ данных с помощью программного обеспечения MALS.
Основные результаты
- Успешная характеристика белков и комплексов.
- Проверка чистоты системы и целостности образцов.
- Точное определение молекулярных масс и размеров.
- Идентификация олигомеров и комплексов в образцах.
Выводы
- SEC-MALS является эффективным методом характеристики белков.
- Он позволяет получать абсолютные значения измерений без использования стандартов.
- Данный метод может быть применен к различным биологическим макромолекулам.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Метод SEC-MALS обеспечивает определение абсолютной молекулярной массы и размера белков и комплексов в растворе, что устраняет зависимость от молекулярных стандартов и снижает аналитическую неопределенность на ранних этапах поиска. Эта возможность способствует валидации мишени путем подтверждения биофизического состояния терапевтических кандидатов, включая олигомеры, агрегаты и модифицированные формы, такие как гликопротеины. Предоставляя количественные данные, не зависящие от конформации, SEC-MALS повышает прогностическую уверенность в поведении белков, что помогает при принятии решений о продолжении или прекращении разработки и снижает биологические риски на поздних этапах в биофармацевтических R&D-проектах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: подтверждает гомогенность и молекулярную массу белковых мономеров, олигомеров и комплексов, что позволяет точно оценить целостность терапевтической мишени.
- Практическая ценность: позволяет разграничить статические и динамические белковые равновесия, выясняя, являются ли наблюдаемые формы стабильными агрегатами или продуктами транзиторных взаимодействий.
- Прогностическая ценность: обеспечивает раннее обнаружение агрегатов и гетерогенных популяций, что способствует приоритизации кандидатов с учетом рисков перед дальнейшими инвестициями.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет анализировать модифицированные белки, такие как гликопротеины и мембранные белки, солюбилизированные детергентами, что расширяет спектр доступных мишеней для скрининговых кампаний.
- Практическая ценность: обеспечивает количественное определение абсолютной молекулярной массы для каждого объема элюции, что способствует стандартизации анализа и воспроизводимости результатов в разных лабораториях.
- Полезность платформы: позволяет генерировать справочные данные для BSA и других стандартов, которые могут быть сохранены в качестве методов для последующих запусков SEC-MALS, что способствует повторному использованию и единообразию данных в масштабах всего предприятия.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает характеристику белковых комплексов и модифицированных форм, имеющих значение для механизмов заболеваний, что связывает этап открытия препарата с доклинической валидацией.
- Снижение механистических рисков: позволяет определить, являются ли наблюдаемые формы результатом ковалентной модификации, неспецифической агрегации или специфической олигомеризации, что проясняет механизм действия и риски, связанные с лекарственной формой.
- Доклиническое согласование: предоставляет данные о размере и конформации в растворе, которые дополняют методы структурного анализа, такие как крио-ЭМ или ЯМР, обеспечивая комплексное профилирование мишени.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
SEC-MALS служит основополагающим аналитическим этапом в процессе разработки, который следует за экспрессией и очисткой белков, но предшествует функциональным тестам или структурному анализу, что гарантирует продвижение по pipeline только надлежащим образом охарактеризованных молекул.
- Биология открытий: позволяет подтвердить олигомерное состояние и монодисперсность очищенных белков, что снижает количество ложноположительных результатов в анализах на взаимодействие с мишенью и передачу сигналов.
- Скрининг: гарантирует, что белковые лиганды или аналиты, используемые в скрининговых тестах, являются четко определенными и гомогенными, что повышает качество данных и частоту подтверждения хитов.
- Аналитика: предоставляет данные о среднемассовой молярной массе, размере и массовой доле, что позволяет проводить прямое сравнение вариантов белков, мутантов или условий формуляции.
- Трансляционные исследования: позволяет характеризовать гликопротеины и комплексы мембранных белков в условиях, близких к нативным, что подтверждает значимость биомаркеров и помогает в изучении механизмов действия.
- Корпоративное повторное использование: позволяет лабораториям сохранять валидированные методы (например, на основе BSA) для широкого применения в различных проектах, что сокращает время разработки методов и увеличивает аналитическую пропускную способность.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает абсолютное определение молекулярной массы, не зависящее от конформации, что повышает уверенность в идентичности мишени и снижает неопределенность в понимании механизмов.
- Операционная ценность: позволяет проводить проверку пригодности системы с помощью холостых инъекций и мониторинга частиц, что обеспечивает воспроизводимость анализов и сводит к минимуму количество неудачных экспериментов из-за загрязнения.
- Стратегическая ценность: способствует раннему обнаружению агрегации и неоднородности, что дает важную информацию для разработки рецептуры и снижает риск неудач на поздних стадиях из-за нестабильности.
- Влияние на портфель: позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на основе биофизического качества, что повышает эффективность использования капитала и позволяет продвигать только хорошо охарактеризованных кандидатов.
Особенности реализации
- Требуются навыки очистки белков, приготовления буферов и работы с системой SEC-MALS, включая процедуры юстировки и нормализации детектора MALS.
- Необходим доступ к откалиброванной системе SEC-MALS с малошумящими детекторами светорассеяния и показателя преломления, а также к подходящим колонкам (например, с размером пор 200 Å для BSA).
- Необходима тщательная фильтрация образцов и буферов (0,1–0,2 μm), а также промывка системы для удаления частиц, которые могут рассеивать свет и ухудшить качество данных.
- Для корректного расчета молекулярной массы в программном обеспечении MALS требуется точный ввод специфических параметров белка, таких как dn/dc и коэффициент экстинкции в УФ-области.
- Метод ограничен необходимостью использования монодисперсных растворимых образцов; осадки или крупные агрегаты должны быть удалены путем центрифугирования или фильтрации перед вводом, чтобы избежать засорения колонки и появления артефактов сигнала.
