Визуализация Multiciliated клетки в Zebrafish через комбинированные протокола вся гора флуоресцентные в Situ Гибридизация и иммунофлуоресценции

Общая цель этого протокола заключается в маркировке и визуализации мультиреснитчатых клеток рыбки данио рерио in situ. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии развития, такие как какие факторы регулируют мультиреснитчатые сульфаты в эмбриональной почке рыбки данио? Основное преимущество этого метода заключается в том, что транскрипты белков и РНК могут быть помечены одновременно, что полезно в отсутствие специфических антител к рыбкам данио

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы начали мечить мультиреснитчатые клетки в пронефросе при анализе наличия ресничек после внесения изменений в эмбрион. Начните с фиксации эмбрионов данио-рерио через 24 часа после оплодотворения в пяти миллилитрах 4% параформальдегида в течение двух-четырех часов при комнатной температуре без перемешивания. Затем промойте эмбрионы два раза в PBS с 0,1% Tween 20 или PBST, а затем промывайте пять миллилитров 100% метанола.

Затем инкубируйте эмбрионы в пяти миллилитрах свежего 100% этанола в течение не менее 20 минут при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Чтобы подготовить эмбрионы к гибридизации, регидратируйте новорожденных в пяти миллилитрах 50% метанола и PBST в течение пяти минут, а затем в течение пяти минут в пяти миллилитрах 30% метанола и PBST. Промойте эмбрионы два раза по пять минут каждый в пяти миллилитрах PBST и инкубируйте эмбрионы в пяти миллилитрах раствора протеиназы К 1 к 1000 и PBST в течение двух минут, сразу после чего последует еще два промывки в пяти миллилитрах PBST.

Зафиксируйте эмбрионы в пяти миллилитрах 4%-ного параформальдегида не менее чем на 20 минут при комнатной температуре с последующим двумя промывками в пяти миллилитрах PBST 20. Чтобы облегчить взаимодействие между эмбрионами и гибридизационным раствором, перенесите эмбрионы в пять миллилитров PBST в вертикальные микроцентрифужные пробирки с плоским дном в микроцентрифужном штативе и промойте эмбрионы два раза по пять минут каждый в 1,5 миллилитрах гибридизационного раствора. После второй промывки инкубируйте эмбрионы в 1,5 миллилитрах свежего гибридизационного раствора при температуре 70 градусов Цельсия в гибридизационной печи в течение четырех-шести часов.

Затем замените раствор для гибридизации 10 микролитрами интересующего РНК-зонда и 500 микролитрами раствора для гибридизации зонда на ночь при температуре 70 градусов Цельсия. На следующее утро промойте эмбрионы два раза в 1,5 миллилитрах 50% формамида и 2X солево-натриевого цитратного буфера или SSC в течение 20-30 минут на промывку при температуре 70 градусов Цельсия. Затем промойте эмбрионы один раз в 1,5 миллилитрах только 2X SSC при 70 градусах Цельсия в течение 15 минут, а затем дважды промойте в 1,5 миллилитрах 0,2X SSC при 70 градусах Цельсия в течение 20-30 минут за одну промывку.

После второй промывки замените 0,2X SSC на 1,5 миллилитра блокирующего реагента для ночной инкубации при четырех градусах Цельсия. На следующее утро замените блокирующий реактив на 0,2 миллилитра антидигоксина в пероксидазе хрена и блокирующем реактиве в соотношении один к 1 000 для трехчасовой инкубации при комнатной температуре, защищенной от света. Затем промойте эмбрионы два-четыре раза в 1,5 миллилитрах буфера яблочной кислоты в течение 10-15 минут за одну промывку, а затем проведите ночную инкубацию при четырех градусах Цельсия в 1,5 миллилитрах свежего буфера яблочной кислоты.

На следующее утро замените буфер яблочной кислоты на 1,5 миллилитра PBS и промойте эмбрионы два раза в 1,5 миллилитрах PBS в течение пяти минут за одну промывку. Инкубируйте эмбрионы в 0,2 миллилитра флуоресцентного раствора Si3 в течение 60 минут с последующим четырьмя последовательными 10-минутными промывками в 1,5 миллилитрах возрастающей концентрации метанола. После последней инкубации инкубируйте зародыши при комнатной температуре в 1,5 миллилитрах 1%-ной перекиси водорода и метанола в течение 30 минут.

Затем промойте эмбрионы в течение 10 минут за одну промывку в 1,5 миллилитрах нисходящих растворов метанола, а затем последуйте за двумя пятиминутными промывками в 1,5 миллилитрах PBS. Далее промойте эмбрионы в 1,5 миллилитрах дважды дистиллированной воды в течение пяти минут с последующей семиминутной промывкой в 1,5 миллилитрах минус 20 градусов Цельсия ацетона. Промойте эмбрионы еще в 1,5 миллилитрах дважды дистиллированной воды в течение пяти минут, а затем промывайте в течение пяти минут в 1,5 миллилитрах PBST с 1% ДМСО или PBDT.

Инкубируйте эмбрионы при комнатной температуре в 1,5 миллилитрах PBDT с 10% FBS на коромысле в течение двух часов. Затем замените PBDT и FBS 1,5 миллилитрами первичных антител для ночной инкубации при четырех градусах Цельсия. На следующее утро промойте эмбрионы в 1,5 миллилитрах PBDT, FBS и 0,1 молярного хлорида натрия в течение одной минуты с укачиванием с последующим пятью 30-минутными укачиванием в 1,5 миллилитрах PBDT, FBS и хлорида натрия.

После последнего промывки промыть эмбрионы однократно в 1,5 миллилитрах ПБДТ и FBS всего в течение 30 минут с последующим укачиванием с последующей ночной инкубацией в 200 микролитрах соответствующих вторичных антител при четырех градусах Цельсия, защищенных от света. На следующее утро быстро промойте эмбрионы два раза в 1,5 миллилитрах PBDT с последующей 15-минутной инкубацией в 1,5 миллилитрах DAPI на качалке. Затем промойте эмбрионы три раза в 1,5 миллилитрах PBDT с FBS и хлоридом натрия в течение 15-20 минут за одну промывку и храните эмбрионы в 1,5 миллилитрах PBDT при четырех градусах Цельсия в защищенном от окружающего света месте.

Чтобы получить изображение почек данио-рерио, положите эмбрионы сбоку на предметные стекла примерно в 10 микролитров PBDT. С помощью пары тонких щипцов и препарирующего микроскопа сожмите первый эмбрион за глазами, чтобы удалить голову и часть желткового шарика. Затем аккуратно соскребите оставшийся желточный шарик с тела эмбриона.

При извлечении желткового шарика будьте осторожны и не прикасайтесь к расширению желточного мешка, так как интересующая ткань легко рвется и находится непосредственно над удлинителем. С помощью тонкой салфетки удалите диссоциированный желток и лишнюю жидкость со предметного стекла. Затем добавьте каплю монтажной среды в оставшийся хвост и расположите хвост сбоку.

Расплющите хвост с помощью чехлового стекла и поместите горку в закрытый ящик для слайдов. Затем используйте объектив 60X на конфокальном микроскопе, чтобы получить изображение ресничек почек на соответствующих флуоресцентных каналах. На следующих репрезентативных изображениях эмбриона рыбки данио, окрашенного как только что продемонстрированное, мультиреснитчатые клетки могут быть идентифицированы на основе визуализации антисмыслового рибозонда, используемого для распознавания экспрессии транскрипта ODF3B, меченных гаметным тубулином базальных тельцах и ацетилированных альфа-тубулинов, меченных ресничками.

Действительно, при таком увеличении эмбрионального пронефроса можно наблюдать многореснитчатую клетку с транскриптами ODF3B, множественными базальными тельцами и ресничками. Соседнюю моноцилийную клетку можно отличить по одному базальному телу и единому фенотипу ресничек. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости использовать только что зафиксированные эмбрионы и защищать образцы от окружающего света после добавления первых антител.