Количественная оценка самообновления в культурах Murine Mammosphere

Здесь мы описываем реализацию и интерпретацию результатов количественного анализа самообновления in vitro mammosphere.

Таким образом, маммосферные культуры обеспечивают легкодоступную моторную систему для изучения и вскрытия важных аспектов нормального поведения стволовых клеток молочной железы, включая их способность к самообновлению и дифференциации. Наш количественный подход направлен на оценку темпов роста маммосферных культур объективным образом, что позволяет проводить прямое сравнение различных типов клеток и условий. Для первого испытания, я бы посоветовал держать жесткий контроль над инкубации раз, чтобы избежать чрезмерного пищеварения и обеспечить точное количество клеток перед каждым покрытием.

Демонстрацией процедуры с Charolaise Bull будет Эррико Д'Элиа, техник из моей лаборатории. После сбора четырех брюшной и нижней грудной маммографии железы от 5 до 30, от 8 до 10 недель самки мышей, место до 20 желез на 100 миллиметров Петри блюдо в минимальном объеме DPBS. Измельчите ткани на мелкие кусочки и добавьте к фрагментам 10 миллилитров пищеварительной среды.

Используйте 25 миллилитров серологической пипетки для передачи частей ткани в 50 миллилитров конической трубки и печать трубки с парафиновой пленкой. Затем инкубировать фрагменты на ротаторе при 0.03 X G в течение 2 1/2 часов при 37 градусах и 5%углекислом газе с влажностью. В конце инкубации, если все фрагменты могут быть переданы через кончик трубы P1000, осадок ткани суспензии центрифугации и тщательно декантировать супернатант.

Повторно приостановить гранулы в 3 миллилитров PBS и фильтровать содержимое трубки последовательно через один 100, 170, 140 микрометров ячейки ситечко в новую коническую трубку, мыть каждый ситечко с 2 миллилитров свежего DPBS после каждого фильтра. Пеллет клетки центрифугации и декантировать супернатант повторно приостановления клеток в оставшихся DPBS. Смешайте клетки с равным объемом буфера хлорида аммония калия и подлизайте красные кровяные тельца на льду на срок до 5 минут.

В конце инкубации, арестовать лиза с 10 миллилитров DPBS и собирать клетки центрифугации. Подтвердите наличие белой гранулы и повторно приостановите гранулы в 1 до 5 миллилитров маммосферной среды для подсчета. Затем пластины клеток на не-ткани культуры обработанных ультра низкой адгезии шесть пластин хорошо на 2 х 10 до пятой жизнеспособных клеток на миллилитр маммосферы средней концентрации для 7 до 10 дней инкубации при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа.

В конце 7 до 10 дней культуры, собирать первичные маммосферы из каждого колодец клеточной культуры пластины и осадок маммосферы путем цецифугации. После декантирования супернатанта используйте пипетку P200 с отфильтрованным наконечником для пипетки маммосфер примерно 100 раз. Поколение пациентов с одиночными клетками имеет решающее значение для точной количественной оценки маммосферной клетки для новой лабельности.

Визуально проинспектировать степень сегрегации и при необходимости использовать клеточный ситечко. Повторно приостановить диссоциированных маммосфер с 1 до 5 миллилитров свежей маммосферы среды для подсчета и пластины 2 X 10 до четвертого жизнеспособных клеток на миллилитр на полихемы покрытием ультра низкой адгезии шесть пластин хорошо для 5 до 7 дней культуры. Затем, через 5-7 дней, подсчитайте количество сфер на колодец.

В конце каждого отрывка используйте цифровую камеру, установленную на стереоскопе, для сканирования всей поверхности всех скважин для изображения сфер. После сохранения изображений, как tif файлов, импортировать стереоскоп изображения в качестве последовательности изображений в ImageJ и установить масштаб и тип изображения на 8-битный. Дублируйте стопку изображений и выберите subtract Background из вкладки Process.

Проверьте фон света и раздвижные параболоидные параметры и нажмите OK, чтобы обработать все изображения стека. Выберите Настроить и Порог из вкладки Изображение и нажмите применить. Появится всплывающее окно.

Выберите по умолчанию в качестве метода и света в качестве фона. Проверьте порог расчета для каждого окна изображения и нажмите OK. Чтобы обработать все изображения в стеке, выберите Watershed и нажмите Да. Выберите Open и нажмите Да и выберите Erode и нажмите Да.

Далее выберите Анализ частиц из меню Анализ и установите минимальный порог размера в 10 000 микрометров в квадрате и круговорот между 0,50 и 1,00. Выберите опцию Ellipses из меню Show drop down menu и проверьте Summarize, Exclude on edges и In situ Show. Затем нажмите OK, чтобы обработать все изображения стека.

Для расчета кривой кумулятивного роста для каждого прохода регистрируется количество помойных ячеек и количество ячеек в сферах, подсчитанных на колодец, и вычисляется размер сферы в конце каждого прохода. Вывод числа поцаривных сфер, путем деления числа ячеек, потроханых для каждого прохода, на размер сферы, рассчитанный в конце предыдущего прохода. Рассчитайте кумулятивное число ячеек для каждого хорошо за проход и кумулятивное число сферы для каждого хорошо за проход и построить точки данных по полулогаритмической шкале.

Затем экспоненциальная линия тренда к точкам данных и рассчитать коэффициент определения для измерения пользы подходят. Затем изобразить уравнение линии тренда как естественную экспоненциальную функцию, чтобы сделать вывод о темпах роста культуры. В этом эксперименте были определены сфера и число клеток из пяти последовательных проходов для трех независимых экспериментов.

Здесь на кумулятивных номерах клетки и сферы в проход показаны. Как отмечает активация Myc, приводит к увеличению сферы и темпов роста клеток. Биологические и соответствующие точки времени могут быть выбраны для сбора клеток или для выполнения анализа экспрессии генов или других функциональных активов для оценки дифференциации клеток, миграции и вторжения.

Это простой и экономически эффективный подход с несколькими приложениями. Например, он может быть использован в прямом открытии для измерения воздействия на распространение стволовых клеток рака и самообувечение.