Визуализация и количественная оценка высокомерных данных цитометрии с использованием Cytofast и upstream кластерных методов FlowSOM и Cytosplore

Данные, генерируемые массовой цитометрией, сложны и нуждаются в визуализации эффективным и простым способом. Cytofast это метод, который подчеркивает иммунологические модели в популяции иммунных клеток и определяет клеточные подмножества, которые связаны с клиническим лечением или экспериментальных групп. Cytofast может быть применен после любого метода кристаллизации, как FlowSOM или Cytosplore.

Это позволит вам обнаружить подмножество клеток, которые связаны с клиническим лечением или экспериментальной группы. С помощью этого метода вы сможете увидеть иммунологический обзор данных с первого взгляда в количественном порядке. Начните с создания кластеров с помощью Cytosplore или FlowSOM.

При использовании Cytosplore загрузите файлы FCS, нажав на Файлы и откройте файлы FCS. Затем выберите кофактор для гиперболической трансформации ArcSinh при запросе и нажмите на добавление уникального тега образца в качестве канала. Выберите запустить HSNE для запуска уровня HSNE из трех и ждать, пока карта будет создана.

На первом уровне HSNE проверьте ячейки, которые являются положительными для CD161, выбрав положительные ячейки CD161 и правое нажатие зум в выборе. На втором уровне повторите процедуру, чтобы достичь третьего уровня только с CD161 положительные события. После того, как будет создана последняя карта TSNE, сохраните кластеры, определенные Cytosplore, нажав правой кнопкой мыши на карте и выбрав кластеры сохранения.

Выберите каталог выходных файлов по запросу Cytosplore и обратите внимание на это место, потому что позже он будет использоваться для загрузки файлов FSC в R.Use простое имя символов только при переименовании выходных файлов, которые сделают идентификацию и дальнейшую обработку проще и выбрать сохранить. Загрузите файлы в R с обозначенной функцией readcytosploreFCS. Для очистки данных удалите некоторые параметры, такие как время и фон, проверив положение столбца, связанное с его ненужными параметрами, и удалив его из матрицы.

Затем переупорядочить маркеры так, чтобы маркеры линии отображались сначала с последующими функциональными маркерами. Свяжите файл метаданных с генерируемыми данными из Cytosplore, загрузив метафилу электронной таблицы, содержащую клиническую информацию. Для выполнения кластеризации FlowSOM загрузите необработанные данные, которые ранее были закрыты на CD161 положительные события в R с чтением.

функция flowSet. Выберите соответствующие биологические маркеры, выбрав соответствующие столбцы и преобразовав данные в arcSinh5 образом. Нанесите кофактор из пяти человек, выбрав в функции cofacter-5.

Кластерные данные с использованием функции FlowSOM и сравните FlwoSOM и Cytosplore, выбрав кластеризацию данных в 10 подмножествах так же, как выход, ранее полученный Cytosplore. Затем назначьте каждую ячейку в идентифицированный подмножество и образец ID.Load файл метаданных в R, содержащий групповое назначение, и свяжите его с файлами FCS, используя код из текстовой рукописи. Создайте список CF на основе кадра данных, полученного из FlowSOM.

Затем переупорядочить маркеры, чтобы появиться аналогично выходу из анализа Cytosplore. Перед созданием тепловых карт создайте таблицу подсчета на выборку с помощью функции cellCount. Поскольку некоторые кластеры содержат меньше ячеек, чем другие, масштабировать данные на кластер, указывая scale'true внутри функции, что позволяет легко увидеть дисперсию между образцами.

Визуализировать данные с тепловой картой затем визуализировать с участками коробки, генерируя количество ячеей, но не масштабирование данных для получения частоты каждого кластера. Наконец, визуализировать интенсивность выражения маркеров CD45, CD11c и CD54 с помощью имен маркеров и включения их в функцию сюжета MSI. Cytofast выполняет несколько возможных выходов, включая тепловую карту всех кластеров, выявленных в анализе и основанных на выражении маркера.

Дендрограмма сверху представляет собой иерархическое сходство между идентифицированных кластерами. Верхняя панель отображает другую тепловую карту, показывающую относительное количество соответствующих подмножественн в каждом образце. Между тем, дендрограмма справа показывает сходство между образцами на основе подмножества частот, демонстрирующих, что фенотип естественных клеток-убийц формируется путем лечения PD-L1 через три дня после инъекции.

Комбинированные тепловые карты могут быть получены для FlowSOM с последующим Cytofast и для Cytosplore следуют Cytofast. Cytofast также может быть использован для количественного представления данных и отображения результатов в участках коробок. Еще одной особенностью, которая включена в пакет Cytofast, является функция участка MSI, которая показывает средний участок интенсивности сигнала каждого маркера на группу.

Эта функция позволяет обнаруживать глобальные изменения, такие как увеличение экспрессии CD54 или CD11c в естественных клетках-убийцах обработанной группы PD-L1. Этот метод является быстрым способом визуализации и количественной оценки данных и может быть использован для обнаружения новых клеточных реакций после терапии. После этого метода глобальный тестовый пакет в R может быть использован для тестирования группы ковариатов на связь с переменными ответа.

Это покажет корреляцию между каждым подмножествам и клиническим исходом.