Подготовка биологических образцов к видообразованию при криогенной температуре с использованием рентгеновской абсорбционной спектроскопии высокого разрешения

Этот протокол был стандартизирован для клеточных образцов, что позволяет сравнивать эксперименты, проводимые в разных местах синхротрона. Основным преимуществом данной методики является простой и понятный рабочий процесс, который позволяет быстро и надежно сохранять химическую интеграцию образца. Люди, не знакомые с этим методом, могут бороться с гранулированием замороженных итерированных клеток и быстрой загрузкой клеточных гранул в порядок криосамплей.

Точное и быстрое разъединение образцов при криогенной температуре имеет решающее значение. Таким образом, визуальная демонстрация необходима для понимания того, как выполнять технику. Чтобы подготовить гранулы клеток клеточной линии рака предстательной железы и яичников человека к видообразованию селена, засейте соответствующее количество клеток из каждой клеточной линии в три колбы Т-75 для каждого условия в соответствующей среде клеточной культуры в ламинарной проточной вытяжке и поместите колбы в инкубатор культуры клеток с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа до тех пор, пока клетки не станут на 80% сливающимися.

Чтобы подвергнуть раковые клетки обработке селеном, сначала обжарьте ультразвуком свежеприготовленные растворы наночастиц на ультразвуковой водяной бане в течение 30 минут при комнатной температуре, прежде чем последовательно разбавлять раствор наночастиц селена в полной клеточной культуральной среде до соответствующих рабочих концентраций. В ламинарной вытяжке аккуратно промыть клетки два раза пятью миллилитрами 37 градусов Цельсия PBS за стирку и используйте стерильную 25-миллилитровую пипетку, чтобы аккуратно добавить 15 миллилитров селеновой обработки, представляющей интерес, на дно колбы. Закройте крышки, не полностью запечатывая колбу, и поместите колбы горизонтально в инкубатор культуры клеток на 24 часа.

Чтобы приготовить гранулы клеток после промывки и пополнения питательной среды, используйте один клеточный скребок на колбу, чтобы аккуратно отсоединить клетки. Используйте среду для промывки любых клеток, прилипших к колбе, в супернатант и сбора диссоциированных клеток путем центрифугирования. Промывайте гранулы два раза в пяти миллилитрах PBS на пробирку за промывку, чтобы удалить все оставшиеся следы обработки и повторно суспендировать клетки в одном миллилитре PBS.

Переместите ячейки в полипропиленовую трубку объемом 1,5 миллилитра и соберите ячейки с помощью другого центрифугирования. Затем используйте пипетку объемом 200 микролитров, чтобы аккуратно удалить весь супернатант и погрузить нижнюю часть каждой 1,5-миллилитровой трубки в жидкий азот до уровня гранулы ячейки. Сразу после замораживания переложите трубки в жидкий азотный дьюар для длительного хранения.

Для спектроскопии поглощения рентгеновского излучения высокого разрешения оптимизируйте все кристаллы спектрометра кристаллического анализатора в условиях Брэгга по отношению к интересующей энергии линии флуоресценции и используйте эталон, для которого, как известно, энергетическое положение края поглощения калибрует падающую энергию монохроматического пучка. Перенесите держатель образца в жидкий криостат гелия для биологических образцов и установите криостат на 10 градусов Кельвина, затем закройте экспериментальную хижину, следуя правилам синхротронной безопасности, и начните анализ. Здесь репрезентативные спектры рентгеновской абсорбционной спектроскопии высокого разрешения селена в исходном состоянии и в клетках, инкубированных в питательную среду, демонстрируют, что селен в исходных наночастицах селена присутствовал как в виде нуля селена, так и в виде целлюлитоподобных форм.

Однако после взаимодействия с клетками PC3 селен в основном присутствовал в клетках в виде нулевого селена, демонстрируя изменение видов селена в клетках. Для железа эталонные спектры рентгеновской абсорбционной спектроскопии высокого разрешения демонстрируют различные положения краев в зависимости от степени окисления железа, при этом восстановленные виды железа смещаются к низким энергетическим значениям. Два последовательных спектра, собранных в одном и том же положении гранулы диатомовых водорослей, были похожи, что указывает на то, что повреждение пучка было ограничено между двумя приобретениями при использовании криостата гелия при 10 Кельвинах.

Кроме того, спектры из разных положений гранулы диатомовых водорослей были идентичными, демонстрируя, что гранула образца однородна и что спектры могут быть усреднены для получения лучшего спектра отношения сигнал/шум. Наиболее важными этапами являются подготовка дилдтуиона наночастиц, гранулирование при криогенной температуре и подготовка стандартных эталонных образцов. Эта процедура может быть применена к другим объемным аналитическим методам, таким как ICP-MS или HPLC-ICP-MS или другим несинхротронным спектроскопическим методам, которые могут быть выполнены при криогенной температуре.

Другие научные вопросы могут быть изучены с использованием этой процедуры, особенно в области биогеологии, биохимии и наук об окружающей среде или токсикологических исследований. Соединения селена и наночастицы селена могут быть столь же трудными для вашего здоровья и должны обрабатываться в специальном химическом капюшоне с использованием перчаток, очков и маски для лица.