Мониторинг сборки eIF4F путем измерения взаимодействия eIF4E-eIF4G в живых клетках

Регуляция передачи сигналов комплекса eIF4F связана с увеличением трансляции субпопуляции мРНК, которые участвуют в пролиферации и выживаемости рака. В данной статье мы описываем анализ белок-белкового взаимодействия на основе eIF4E-eIF4G, который позволяет нам оценить индуцированное лекарственными препаратами возмущение целостности комплекса eIF4F в живых клетках. Растет интерес к разработке модальностей, которые эффективно нацелены на белок-белковую границу.

Мы предполагали, что наши анализы eIF4E-eIF4G PPI помогут в развитии этих стратегий и их валидации. Этот анализ позволит обеспечить оптимальную первичную схему для его оптимизации ингибиторов eIF4E-eIF4G. Правильный засев клетки и выполнение передаточной трансфекции являются наиболее сложными аспектами этого продукта, поскольку они могут напрямую отражаться на подавлении системы отчетности по ИПП.

После размораживания и подсчета ячеек засейте в 6 луночных планшетов клетками HEK 293, используя 2 миллилитра стандартной питательной среды на лунку. Утром 2-го дня для каждой запланированной трансфекции разводят 9 микролитров раствора на основе липосом в пробирке, содержащей 125 микролитров восстановленной сывороточной среды без фенольного красного. В то время как разведенные липосомы инкубируются при комнатной температуре в течение 5 минут, приготовьте мастер-смесь ДНК, разбавив 3 мкг каждой плазмиды в 125 микролитрах восстановленной сывороточной среды для каждой трансфекционной трубки.

Добавьте 12 микролитров реагентов-энхансеров в мастер-смесь ДНК 2, затем хорошо перемешайте. Сразу же добавьте эту смесь в каждую тубу разведенных липосом в пропорции 1 к 1. После инкубации этого липидного комплекса ДНК в течение 15 минут при комнатной температуре, добавьте комплекс в каждую лунку из 6 луночных планшетов.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 24 часов. Утром 3-го дня промойте каждую лунку 1 миллилитром PBS и добавьте 0,3 миллилитра трипсина. Инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия в течение 5 минут.

После инкубации нейтрализуйте трипсин, добавив по 2 миллилитра в каждую лунку восстановленной сыворотки среды без фенолового красного. Переложите трансфицированные клетки в пробирку объемом 15 миллилитров. Затем центрифугируйте клетки при 290x G в течение 5 минут.

Аспирируйте среду и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 2 миллилитрах восстановленной сывороточной среды. Засейте трансфицированные клетки HEK 293 в 96-луночные непрозрачные планшеты с плотностью 30 000 клеток на лунку в 90 микролитрах среды. Чтобы получить 3 технических повтора для 3 различных соединений в рамках одного эксперимента, засейте 60 лунок.

Исключите углубления по краям. Сразу после посева трансфицированных клеток добавьте в каждую лунку по 10 микролитров 10%-ного раствора ДМСО. Приготовьте 1 миллимолярный исходный раствор соединения, растворив каждое интересующее соединение в 100% ДМСО.

Для того, чтобы получить 3 репликации для каждого титрования соединения, используйте 8 микролитров 1 миллимолярного исходного раствора соединения. Проводят двукратное последовательное разведение каждого исходного раствора в 8 лунках 96-луночного ПЦР-планшета путем пипетирования 4 микролитров 1 миллимолярного запаса в 4 микролитра 100% ДМСО для каждой точки титрования. Откажитесь от лишних 4 микролитров после последнего пункта двукратного серийного разведения.

Добавьте 36 микролитров стерильной воды класса ВЭЖХ в каждую пробирку, чтобы приготовить 40 микролитров 10-кратного составного серийного разбавления в 10% ДМСО. Также подготовьте контроль. 10% Только складской раствор DMS в стерильной воде класса ВЭЖХ.

Добавьте 10 микролитров 10-кратных рабочих растворов в ячейки в 96-луночной непрозрачной пластине, чтобы получить предполагаемую концентрацию конечной концентрации, с остаточной концентрацией ДМСО 1%. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 3 часов. Через 3 часа начните приготовление реагента для субстрата люциферазы, соединив 1 объем субстрата с 19 объемами реагента для разведения. С помощью многоканальной пипетки немедленно добавьте 25 микролитров реагента для субстрата в каждую лунку 96-луночного планшета с клетками.

Встряхните пластину на орбитальном вибростенде со скоростью 350 об/мин в течение 50 минут при комнатной температуре. Чтобы оценить люминесценцию, поместите пластину на считыватель пластин. Установите считыватель зеркал на люминесценцию, а фильтр излучения на 455.

Используйте высоту измерения 6,5 миллиметров со временем измерения 1 секунда. Чтобы оценить жизнеспособность клеток, добавьте в каждую лунку по 33 микролитра реагента для анализа жизнеспособности. Через 15 минут при комнатной температуре оцените люминесценцию с помощью считывателя пластин, установив зеркальный считыватель на люминесценцию, а фильтр излучения на 600.

Используйте высоту измерения 6,5 миллиметров и время измерения 1 секунду. Используйте данные со считывателя планшетов для определения значения IC 50 для каждого соединения, подгоняя данные к уравнению кривой подгонки по 4 параметрам, описанному в рукописи. Клетки HEK 293 трансфицировали с помощью системы комплементации eIF4E-eIF4G, а затем удаляли и обрабатывали ингибиторами mTOR.

Когда люминесценция оценивалась через 4 часа после лечения, PP242 и рапамицин вызывали дозозависимое ингибирование сигнала. Ни PP242, ни рапамицин не вызывали значительного снижения жизнеспособности клеток, что указывает на то, что снижение люминесценции в системе комплементации eIF4E-eIF4G связано не с неспецифической гибелью клеток, а скорее с нарушением взаимодействия EIF4E-4G. Вестерн-блоттинг, проведенный после эксперимента по снижению мощности m7GTP, показал, что 4EBP1 опосредует нарушение эндогенного взаимодействия eIF4E-eIF4G, коррелирует с измеренным сигналом анализа eIF4E-eIF4G.

PP242 был более мощным ингибитором общего фосфорилирования 4EBP1, чем рапамицин. Оба ингибитора показали нормальное влияние на передачу сигналов mTOR, при этом рапамицин был более активен в отношении субстратов mTORC1, а PP242 нацеливался как на mTORC1, так и на mTORC2. Наиболее важными аспектами этого продукта являются засеивание клеток в день транзакции, повторное засеивание клеток в среде без фенольного красного, оценка люминесценции анализа комплемента eIF4E-eIF4G и проведение анализа жизнеспособности на том же планшете.

Вторичный анализ жизнеспособности может быть проведен для оценки любого препарата с мишенью и известными специфическими эффектами.