Идентификация белков взаимодействию Партнеры в клетках млекопитающих Использование SILAC-иммунопреципитации количественная протеомика

Общая цель этой процедуры заключается в определении партнеров по взаимодействию белков для данного белка, представляющего интерес. Это достигается путем выращивания клеток в средах для культивирования клеток, содержащих аргинин и лизин, меченные различными стабильными изотопами углерода и азота. Второй шаг заключается в трансфекции плазмид и покрытии представляющего интерес белка или контрольной плазмиды в меченые клетки.

Затем клетки лизируются, и образцы подвергаются иммуноосаждению из лизатов. Затем равные объемы контрольных и образцовых иммуноципитатов объединяют и отправляют на анализ lc MS MS. Заключительным этапом является анализ данных масс-спектрометрии для выявления белков, взаимодействующих с интересующим белком.

В конечном счете, мечение стабильными изотопами аминокислот в клеточной культуре или осаждении силаковых аминокислот способно идентифицировать большое количество как прямых, так и косвенных взаимодействий с белком, представляющим интерес, из клеток тканевой культуры. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как тап-тегирование, заключается в том, что он избавляет исследователя от необходимости отсылать отдельные полосы от масс-спектрометрии. Это устраняет важный источник систематической ошибки, одновременно повышая чувствительность.

Хотя этот метод может быть использован для получения информации о клеточном белке, белковые взаимодействия также могут быть применены к другим системам, таким как изучение взаимодействий патогена с хозяином. Для начала соскоб меченых SLAC HEK 2 93 Т-клеток, экспрессирующих интересующий вас белок, меченный GFP, или контроль GFP из чашки для клеточной культуры в ледяную PBS, затем центрифугировать клеточную суспензию при 220-кратном G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, промыть клетки еще три раза в 10 миллилитрах ледяного PBS, ресуспендировать клеточную гранулу в 200 микролитрах буфера для лизиса клеток, содержащего свежедобавленный коктейль ингибиторов протеазы. три при одной концентрации X и добавьте пять микролитров коктейля РНК на миллилитр буфера для лизиса, инкубируйте на льду в течение пяти минут. Затем центрифугируйте клеточный лизат при 13 000 умноженных на G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и сохраните надосадочную жидкость в качестве растворимого клеточного лизата.

Измерьте концентрацию белка в клеточном лизате с помощью анализа A BCA. Затем нормализуют концентрацию белка в каждом образце лизата в конечном объеме 500 микролитров с помощью буфера для лизиса, содержащего ингибиторы протеазы. Добавьте 500 микролитров буфера для разведения, содержащего один х коктейль ингибиторов протеазы, три к каждому из нормализованных клеточных лизатов, чтобы довести общий объем до одного миллилитра.

Храните лизаты на льду во время приготовления гранул против GFP и сохраняйте 50 микролитров аликвоты каждого образца, которая будет использоваться для ввода образца. Перебейте суспензию в суспензию, чтобы снова подвесить бусины. Затем с помощью наконечника для пипетки объемом 200 микролитров с отрезанным концом переложите 25 микролитров гранул на образец в свежую пробирку.

На каждые 25 микролитров суспензии гранул добавьте 20 объемов разбавляющего буфера для промывки, центрифугируйте шарики при 2,700 G в течение пяти минут. Промойте шарики до дополнительного количества с 20 объемами буфера для разбавления. Далее добавьте 100 микролитров разбавляющего буфера на 25 микролитров суспензии.

Затем с помощью наконечника для пипетки объемом 200 микролитров с отрезанным концом передайте 85 микролитров суспензии суспензии в каждый из меченых SLAC образцов Lysates. Инкубируйте образцы с шариками на вращателе при четырех градусах Цельсия в течение двух часов после того, как образцы инкубируются с шариками, центрифугируйте образцы при температуре 2700 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Оставьте 50 микролитров надосадочной жидкости в качестве несвязанного образца и выбросьте оставшуюся часть надосадочной жидкости.

Ресуспендируйте шарики в каждой пробирке в одном миллилитре буфера для разбавления, а затем центрифугируйте при температуре 2700 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Повторите этот шаг промывки дважды, чтобы вымыть белок из бусин. Добавьте 50 микролитров двух загрузочных буферов XSDS в каждый образец и нагревайте до 95 градусов Цельсия в течение 10 минут.

После завершения нагрева центрифугируйте каждый образец при температуре 2,700 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите надосадочную жидкость в предварительно смазанные пробирки и храните при отрицательной температуре 80 градусов Цельсия до тех пор, пока не будете готовы к сдаче на анализ на рассеянный склероз. Затем смешайте равные объемы контрольных и образцовых аминоосадков и отправьте объединенный образец в масс-спектрометрическую установку для анализа lc ms MS.

Прежде чем анализировать данные масс-спектрометрии, скопируйте необработанные данные в новую таблицу. Затем в этой таблице удалите все столбцы, кроме столбцов, содержащих номер присоединения, количество уникальных соотношений пептидов, сравниваемые образцы, вариабельность соотношения и описание белка. Используйте функцию сортировки Excel, чтобы упорядочить данные по количеству пептидов и удалить записи для белков, в которых отсутствует более одного пептида.

Затем отсортируйте по соотношению и удалите белки, в которых отсутствуют соотношения SLAC. Затем преобразуйте коэффициенты slac в log два значения. Использование формулы равно логарифмическим скобкам, отношение SLAC два и скобки, где отношение SLAC подставляется вместо идентификатора ячейки.

Затем создайте новый столбец в файле Excel и вычислите два коэффициента SLAC для всех образцов фиктивных столбцов для преобразования фиктивного коэффициента выборки в образец фиктивного коэффициента. Используйте формулу, равную единице, деленной на отношение. Откройте призму GraphPad.

Выберите новую таблицу данных и график Выберите столбец из списка в левой части окна и нажмите кнопку Введите данные импорта. Введите параметры значений реплики, уложенных в столбцы. Нажмите кнопку «Создать».

Затем выберите и скопируйте заданный столбец с двумя образцами фиктивного коэффициента SLAC из таблицы Excel в новый файл призмы. Затем нажмите на выпадающее меню вставки и выберите новый анализ. В разделе Анализ столбцов выберите частотное распределение.

Оставьте параметры по умолчанию и нажмите OK. В папке результатов будет сгенерирован новый раздел гистограммы. Выберите раздел распределения частот, затем щелкните раскрывающееся меню вставки и выберите новый анализ XY нелинейная регрессионная кривая аппроксимация.

Нажмите на Gaussian distribution и нажмите OK. В появившемся окне результатов задаются среднее значение и стандартное отклонение. Создайте пороговое значение, добавив 1,96 стандартного отклонения к средней доходности в файл Excel.

Создайте новую вкладку с именем «Объединенный столбец меток Присоединение» и скопируйте все номера присоединения из каждого отдельного эксперимента в этот столбец. Далее выберите вкладку данных, а затем опцию удаления дубликатов. Затем создайте столбцы для соотношений SLAC и вариабельности соотношения из каждого эксперимента, а также для столбца с описанием названия белка.

На вкладке описание используйте формулу ВПР для сбора описания каждого номера доступа. Перетащите формулу вниз по столбцу, чтобы заполнить описание белка, а затем используйте эту формулу для получения данных о соотношении и вариабельности из отдельных экспериментов. Чтобы выделить взаимодействующие белки в объединенном наборе данных, обратите внимание на пороговое значение для конкретного эксперимента.

Выберите столбец соотношения и перейдите на вкладку «Главная». Затем следует условное форматирование, выделите ячейки, правила больше правил, затем выберите стиль классического формата только тех продаж, которые содержат стоимость продажи больше или равна. В поле введите значение стандартного отклонения 1,96 и нажмите кнопку ОК.

Оцените вариабельность соотношения для каждого положительного взаимодействия. Если вычесть процент вариативности, то попадание опустится ниже порогового значения. К этому следует относиться с осторожностью.

Повторите это для каждого из столбцов результатов и сравните в разных экспериментах выделенные белки, идентифицированные в двух или более экспериментах, представляют взаимодействие с высокой степенью достоверности. Вестерн-блоттинг подтвердил очистку интересующего нас белка, меченного GFP. Отсутствие полосы ДГ в связанных образцах указывает на то, что невзаимодействующие белки были истощены из образцов на стадии иммунопреципитации, в то время как наличие полосы EIF 4G в этих образцах указывает на то, что известные взаимодействующие партнеры по связыванию были сохранены.

Некоторые из идентифицированных четырех А-связывающих белков EIF были консервативны между двумя изоформами. Белки, которые взаимодействуют с EIF 4 A, идентифицируются высоким коэффициентом LAC, в то время как неспецифически связанные белки в этом эксперименте имеют отношение ниже 0,96. На этой диаграмме комплекса факторов инициации четыре А-связывающих белка EIF, которые были идентифицированы в эксперименте по осаждению аминокислот SLAC, заштрихованы красным или белым.

В соответствии с соотношением log two SLAC, высокий охват как прямых, так и косвенных партнеров по связыванию четырех комплексов EIF A one и two иллюстрирует эффективность этого подхода для идентификации белковых взаимодействий. Лучше всего, если этого можно избежать, обеспечив точную нормализацию уровня поступающего белка и не допустив потери шариков Aros на этапах стирки.