Цитометрический анализ инфильтрации лимфоцитов в Центральной нервной системе во время экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита

Протокол, который мы представляем здесь, будет полезен для нас, чтобы понять, как лимфоциты участвуют в развитии аутоиммунных заболеваний центральной нервной системы. С помощью этого метода, лимфоциты в головном мозге могут быть изучены изучены на клеточной основе. Этот протокол также может быть применен к другим моделям и заболевания центральной нервной системы, которые необходимы для анализа характеристик и функций иммунных клеток.

В этом видео, протокол может легко продемонстрировать, как вызвать модель и изолировать одиночные клетки в головном мозге. После подтверждения отсутствия реакции на педаль рефлекс, использовать один миллилитр шприц подкожно вводить анестезированных C57BL/6 мышей с 100 микрограммов эмульгированных MOG 35-55 в 100 микролитров полного адъюванта Фрейнд в двух различных участках спины вблизи шеи. В тот же день и на второй день постиммунизации, интраперитонно вводить мышей с 200 микролитров одного нанограмма на микролитер коклюша токсина рабочий раствор.

После второй инъекции, передать мышей обратно в свою домашнюю клетку с потеплением площадку и мониторинга до полного лежачих. На следующий день и на протяжении всего заболевания, изучить и оценка всех мышей в ослепленный образом для неврологических признаков, изложенных в таблице и для любых изменений в весе. При соответствующей экспериментальной конечной точке тщательно вырежьте череп от носа к шее и перенесите мозг каждого животного из черепной коробки в отдельные 50 миллилитровых трубок, содержащих 10 миллилитров среды RPMI.

Смешайте трубки хорошо, чтобы удалить приверженец красных кровяных телец и удалить среду по аспирации. Добавьте 10 миллилитров свежей среды в каждую трубку и перенесите мозг в отдельные 100-миллиметровые блюда. Наконец нарезать каждый мозг бритвой и использовать пластиковую пипетку для передачи как можно больше ткани из одного блюда в то время, и шесть миллилитров среды в ледяной семи миллилитр по центру стекла гомогенизатора.

Измельчить мозг, используя свободный поршень пестика перед использованием жесткой поршень довести ткани до подвески однородной. Затем вылейте полученную навозную ткань в предварительно охлажденную 15 миллилитровую коническую трубку на льду. Когда все образцы были гомогенизированы, отрегулируйте объем в каждой трубке до семи миллилитров со свежей средой, прежде чем добавлять каждую подвеску ткани в новую охлажденную 15 миллилитровую трубку, содержащую три миллилитра 100%basement мембранной матрицы на трубку.

Смешайте инверсии несколько раз и использовать три миллилитров пипетки тщательно и медленно добавить один миллилитр 70 процентов плотности градиентного раствора под каждым образцом раствора ткани. Разделит клетки по плотности градиентной центрифугации и удалите почти весь верхний слой, заботясь о том, чтобы полностью удалить весь миелин. Перенесите интерфейс в новую 15-миллилитровую трубку и отрегулируйте громкость до 10 миллилитров со свежей средой.

Затем центрифуга образцов снова и удалить супернатант до повторного перерасхода гранул примерно в 100 микролитров среднего на трубку. Для цитометрического анализа потока собранных клеток мозга, выделить примерно два раза 10 на шесть клеток в 100 микролитров среды в отдельных скважин 96-хорошо пластины. Когда все клетки были поцарнуты, добавьте 100 микролитров коктейля стимуляции клеток 500X плюс ингибиторы транспортировки белка в скважины и поместите пластину в инкубатор клеточной культуры в течение четырех часов.

В конце инкубационный бассейн клетки на дне скважин центрифугации и повторно гранулы в 100 микролитров потока цитометрии буфера на скважину. Предварительно инкубировать клетки с тремя микролитров Anti-Mouse CD16/CD32 Fc Block в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию до окрашивания. Блокировать любые неспецифические fc-опосредованное взаимодействие.

В конце инкубации добавьте к каждому хорошо коктейль из антител, представляющий интерес, и поместите пластину на четыре градуса Цельсия, защищенную от света. Через 30 минут промойте скважины 100 микролитров буфера цитометрии потока на скважину и осадочные клетки центрифугой. Отбросив супернатанты, добавьте к каждой хорошо 200 микролитров внутриклеточного буфера фиксации.

После 30-60-минутной инкубации при комнатной температуре соберите образцы путем центрифугации и повторно посвоит гранулы в 200 микролитров буфера проницаемости 1X на колодец. Центрифуга образцов снова, и после отбрасывания супернатант, повторно гранулы в 100 микролитров со свежим буфером пермялизации. Далее добавьте соответствующие антитела для обнаружения любых внутриклеточных антигенов, представляющих интерес для 30-минутной инкубации при четырех градусах Цельсия, защищенных от света.

В конце инкубации добавьте к каждой колодец 100 микролитров буфера проницаемой промибилизации 1X и вращайте образцы по центрифугации. Затем, повторное приостановление пятна клеток в 200 микролитров потока цитометрии окрашивания буфера и анализировать клетки по потоку цитометрии в соответствии со стандартными протоколами. Типичный клинический курс ЕАО должен привести к кривой заболевания и изменению массы тела, как показано на примере.

C57BL/6 мышей, иммунизированных с MOG 35-55 обычно начинают развиваться симптомы заболевания вокруг день 10 до 12 и достичь пика заболевания около дня 15 до 21. До начала заболевания, вес тела иммунизированных мышей постепенно увеличивается, прежде чем уменьшить корреляцию с растущими симптомами заболевания Мыши демонстрируют самую низкую массу тела на пике ЕАЭ, с массой тела восстановления немного, как клинические симптомы уменьшаются. Мыши обычно не полностью восстановить однако и, как правило, перейти к разработке монофазных хронических заболеваний патологии.

Как показывает этот репрезентативный анализ потока, интерферон гамма-продукции Th1 и IL17 производства Th17 клетки значительно увеличены в EAE мышей. Самый важный шаг 3.10. Оператор должен передать средний слой и свет, будучи тщательно, принять как несколько других слоев, как это возможно.

Следуя этим протоколам, мы можем продолжить Т-лимфоциты для дальнейшего анализа транскрипции для изучения