Индукция экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у мышей и оценка болезни зависимого распределения иммунных клеток в различных тканях

Общая цель модели экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) заключается в содействии изучению потенциальных молекулярных механизмов, лежащих в основе развития рассеянного склероза. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области исследования рассеянного склероза, например, на какой стадии заболевания иммунные клетки проникают в центральную нервную систему? Основным преимуществом данного метода является то, что модель ЭАЭ имитирует многие основные характеристики рассеянного склероза, такие как демиелинизация и инфильтрация иммунными клетками.

Значимость данного метода распространяется на терапию рассеянного склероза, поскольку препараты, протестированные с помощью этого способа, уже были одобрены для лечения этого заболевания. Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, могут столкнуться с трудностями, так как при индуцировании ЭАЭ необходимо учитывать ряд строгих условий. Мышей следует содержать в условиях отсутствия стресса, а токсин коклюша должен быть свежеприготовленным.

Официальная демонстрация данного метода имеет решающее значение, так как изолированию лимфатических узлов и извлечению спинного мозга трудно научиться только по описанию. Начните с подкожного введения самкам мышей в возрасте 10–13 недель 200 мкг миелинового олигодендроцитарного гликопротеина, эмульгированного в 200 мкл полного адъюванта Фрейнда, содержащего 400 мкг mycobacterium tuberculosis.

Сразу после этого и через 24 часа введите мышам внутрибрюшинно 0,2 мкг пертуссисного токсина в 200 мкл PBS. Крайне важно, чтобы перед индукцией EAE мыши были адаптированы как к манипуляциям, так и к условиям экспериментальной среды, чтобы избежать стресса, который может препятствовать развитию клинических симптомов. Через одну неделю после инъекции ежедневно обследуйте мышей на наличие клинических симптомов, описанных в таблице.

Для оценки популяции иммунных клеток лимфатических узлов, индуцированных ЭАЭ, в соответствующий временной интервал после индукции смочите область разреза 80% изопропанолом и осторожно удалите кожу в области бедра. С помощью пинцета аккуратно извлеките паховый лимфатический узел из жировой ткани. Затем взвесьте узел и поместите образец в PBS на льду.

Для анализа клеток спинного мозга смочите спину животного изопропанолом и с помощью скальпеля сделайте продольный разрез вдоль позвоночника. Затем удалите кожу и препарируйте поясничный отдел позвоночника, иннервирующий задние конечности. Промойте позвоночный канал с помощью шприца, заполненного PBS, чтобы извлечь спинной мозг.

После удаления примерно 1/3 поясничного отдела спинного мозга взвесьте фрагмент спинного мозга и поместите ткань в PBS на лед. Для анализа популяции иммунных клеток селезенки вскройте ткани для получения доступа к нижней части брюшной полости. Затем извлеките селезенку и отсеките примерно 1/8 части ткани.

Взвесьте фрагмент селезенки и поместите ткань в PBS на лед. Затем с помощью поршня шприца объемом 2 мл протрите оставшуюся часть ткани через сито с ячеями 70 мкм, установленное на пробирку объемом 50 мл, после чего промойте сито 5 мл PBS. Центрифугируйте отфильтрованные клетки.

Ресуспендируйте осадок в 500 µL буфера для лизиса клеток и перенесите клетки в пробирку объемом 1,5 мл. Через 10 минут выдержки при комнатной температуре дважды промойте клетки в 500 µL PBS. После второго промывания ресуспендируйте осадок в 100 µL 0,2% BSA в PBS и добавьте к клеткам два µL блокирующего буфера для Fc-рецепторов.

После 15 минут выдержки в темноте при комнатной температуре пометьте клетки, добавив 13 µL коктейля антител, и инкубируйте еще 15 минут при комнатной температуре в темноте. По окончании инкубации промойте клетки не менее двух раз в 500 µL PBS и ресуспендируйте полученный осадок в 500 µL свежего PBS. Затем перенесите клетки в пробирку для проточной цитометрии на льду.

Наконец, для анализа образцов методом проточной цитометрии непосредственно перед измерением добавьте к клеткам 30 µL стандарта абсолютного подсчета для проточной цитометрии, чтобы определить абсолютное количество клеток. Затем проанализируйте образцы на проточном цитометре. Как показано на этом рисунке, в острой фазе индукции ЭАЭ наблюдается транзиторное увеличение всех популяций иммунных клеток в лимфатических узлах.

Однако в селезенке повышенная инфильтрация наблюдается только для макрофагов, B-клеток, T-клеток и нейтрофилов. В крови все популяции иммунных клеток демонстрируют временное увеличение в периферическом кровотоке в доклинической фазе, что соответствует аналогичному заболевание-зависимому увеличению в поясничном отделе спинного мозга в острой фазе заболевания, за исключением популяции моноцитов, которые, предположительно, дифференцируются в макрофаги после попадания в спинной мозг. Здесь представлена стратегия гейтирования для оценки различных популяций клеток.

Количество клеток соотносится с объемом анализируемой ткани или крови, что отражает абсолютное число клеток. В лимфатических узлах экспрессия мРНК IL-23 повышается во время доклинической фазы, тогда как экспрессия IL-6 увеличивается по мере прогрессирования заболевания. В селезенке экспрессия IL-6 и IL-23 возрастает в доклинической фазе, в то время как экспрессия мРНК IL-1 beta не изменяется до начала заболевания.

В крови повышается экспрессия только мРНК TNF-alpha, причем эта экспрессия зависит от стадии заболевания. В поясничном отделе спинного мозга в острой фазе индуцируются TNF-alpha, IL-1 beta и интерферон гамма, тогда как IL-6 повышается только в фазе начала заболевания. После освоения модели ЭАЭ последующая изоляция клеток и анализ эффектов могут быть выполнены за восемь часов для десяти мышей при условии правильного выполнения всех этапов.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как Вестерн-блоттинг или ИФА, для подтверждения результатов анализа экспрессии мРНК. Разработка этого метода открыла исследователям в области рассеянного склероза возможность изучить механизмы демиелинизации в центральной нервной системе. После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как индуцировать модель ЭАЭ и как изолировать иммунные клетки для получения воспроизводимых результатов проточной цитометрии.

Не забывайте, что работа с полным адъювантом Фрейнда может быть чрезвычайно опасной; при выполнении данной процедуры следует соблюдать меры предосторожности, такие как приподнимание кожи мыши и обеспечение полного проникновения иглы шприца через кожный покров.