Индукция экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у мышей и оценка болезни зависимого распределения иммунных клеток в различных тканях

В этой рукописи описываются методы индукции и оценки экспериментальной модели аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ), а также оценка распределения иммунных клеток и уровней мРНК-цитокинов в лимфатических узлах, селезенке, крови и спинном мозге с использованием проточной цитометрии и количественной ПЦР, соответственно, на различных фазах заболевания.

Общая цель экспериментальной модели аутоиммунного энцефаломиелита или ЭАЭ заключается в том, чтобы облегчить изучение потенциальных молекулярных механизмов, лежащих в основе развития рассеянного склероза. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области рассеянного склероза, такие как: на какой стадии заболевания иммунные клетки проникают в центральную нервную систему? Основное преимущество этой методики заключается в том, что модель EAE имитирует многие из основных характеристик рассеянного склероза, таких как демиелинизация и инфильтрация иммунных клеток.

Применение этого метода распространяется и на терапию рассеянного склероза, потому что препараты, протестированные с помощью этого метода, уже были одобрены для лечения этого заболевания. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что существуют серьезные условия, которые необходимо учитывать при индуцировании ЭАЭ. Мыши должны содержаться в среде, свободной от стресса, а коклюшный токсин должен быть свежеприготовленным.

Официальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку изоляция лимфатических узлов и удаление спинного мозга трудно узнать только по описанию. Начните с подкожного введения 10-13-недельным самкам мышей 200 мкг гликопротеина миелина олигодендроцитов. эмульгирован в 200 микролитрах полного адъюванта Фрейнда, содержащего 400 мкг микобактерии туберкулеза.

Немедленно и через 24 часа внутрибрюшинно введите мышам 0,2 мкг коклюшного токсина в 200 микролитрах PBS. Важно, чтобы мыши были адаптированы как к обращению, так и к экспериментальной среде до индукции ЭАЭ в сторону индукции стресса, который может предотвратить развитие клинических симптомов. Через неделю после инъекции ежедневно осматривайте мышей на наличие клинических симптомов, как описано в таблице.

Чтобы оценить популяцию иммунных клеток лимфатических узлов, индуцированную EAE, в соответствующий момент времени после индукции смочите область разреза 80% изопропанолом и осторожно удалите кожу над областью бедра. С помощью щипцов аккуратно удалите паховый лимфатический узел из жировой ткани. Затем взвесьте узел, и поместите образец в PBS на лед.

Чтобы проанализировать клетки спинного мозга, намочите спину животного изопропанолом, а скальпелем сделайте продольный разрез позвоночника. Затем снимите кожу и рассеките поясничный отдел позвоночника, иннервируя задние конечности. Промойте позвоночник шприцем, наполненным PBS, чтобы извлечь спинной мозг.

После удаления примерно 1/3 поясничного мозга взвесьте спинномозговой фрагмент и храните ткань в PBS на льду. Чтобы проанализировать популяцию иммунных клеток селезенки, откройте ткань, чтобы получить доступ к нижней части брюшной полости. Далее удалите селезенку, и отрежьте примерно 1/8 часть ткани.

Взвесьте фрагмент селезенки и храните ткань в PBS на льду. Затем с помощью поршня из шприца объемом два мл размачивайте остальную ткань через сито с ячейкой 70 микрон на трубке объемом 50 миллилитров, после чего промывайте фильтр пятью миллилитрами PBS. Центрифугируйте отфильтрованные ячейки.

Ресуспендируйте гранулу в 500 микролитрах буфера для лизиса клеток, и перенесите клетки в пробирку объемом 1,5 миллилитров. Через 10 минут при комнатной температуре промойте клетки два раза в 500 микролитрах PBS. После второй промывки повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах 0,2% БСА в PBS, и добавьте в клетки два микролитра Fc-рецептора одного блокирующего буфера.

После 15 минут в темноте при комнатной температуре пометьте клетки 13 микролитрами коктейля антител еще на 15 минут при комнатной температуре в темноте. По окончании инкубации промойте клетки не менее двух раз в 500 микролитрах PBS, а конечную гранулу повторно суспендируйте в 500 микролитрах свежего PBS. Затем перенесите клетки в проточную цитометрическую пробирку на льду.

Наконец, для анализа образцов с помощью проточной цитометрии, непосредственно перед измерением проточной цитометрии добавьте 30 микролитров стандартного абсолютного количества проточной цитометрии в клетки для определения абсолютного количества клеток. Затем проанализируйте образцы на проточном цитометре. Как показано на рисунке, во время острой фазы индукции ЭАЭ наблюдается временное увеличение всех популяций иммунных клеток в лимфатических узлах.

Однако в селезенке только макрофаги, В-клетки, Т-клетки и нейтрофилы демонстрируют повышенную инфильтрацию. В крови все популяции иммунных клеток демонстрируют преходящее увеличение периферического кровообращения в доклинической фазе, что соответствует аналогичному заболеваемому увеличению поясничного отдела спинного мозга во время острой фазы заболевания, за исключением популяции моноцитов, которая предположительно дифференцируется в макрофаги после входа в спинной мозг. Здесь показана стратегия стробирования для оценки различных клеточных популяций.

Количество клеток связано с количеством анализируемой ткани или объемом крови, что отражает абсолютное количество клеток. В лимфатических узлах экспрессия мРНК IL-23 увеличивается во время доклинической фазы, в то время как экспрессия IL-6 увеличивается в зависимости от заболевания. В селезенке экспрессия IL-6 и IL-23 увеличивается в доклинической фазе, тогда как экспрессия мРНК IL-1 бета не изменяется до начала заболевания.

В крови экспрессия только мРНК TNF-альфа повышена и зависит от заболевания. В поясничном отделе спинного мозга TNF-альфа, IL-1 бета и интерферон гамма индуцируются во время острой фазы, тогда как IL-6 активируется только в начальной фазе заболевания. После освоения модель EAE, последующая изоляция клеток и анализ эффектов могут быть завершены за восемь часов для десяти мышей, если они выполнены правильно.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как Вестерн-блот или ИФА, для подтверждения результатов анализа экспрессии мРНК. После своего развития эта методика открыла исследователям в области рассеянного склероза путь к изучению механизма демиелинизации в центральной нервной системе. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как индуцировать модель EAE и как изолировать иммунные клетки для получения воспроизводимых результатов проточной цитометрии.

Не забывайте, что работа с полным адъювантом Фрейнда может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры следует принять меры предосторожности, такие как поднятие кожи мыши и обеспечение полного проникновения шприца в кожу.